وبلاگ

شکل ۳-۱ دستگاه الکتروفورز افقی
۳-۴-۲ رنگ آمیزی ژل آگارز
در این پژوهش رنگ آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید انجام پذیرفت. اتیدیوم بروماید یک رنگ فلورسانت است که دارای یک گروه سه حلقه‌ای بوده که می‌تواند در بین بازهای DNA جای گیرد. روش کار به‌این گونه است که پرتو فرابنفش به وسیله اسید نوکلئیک گرفته شده و به اتیدیوم بروماید می‌رسد. این پرتو در طول موج ۳۰۲ تا ۳۶۶ نانومتر به وسیله اتیدیوم بروماید پیوسته به اسیدنوکلئیک دریافت شده و دوباره به وسیله اتیدیوم بروماید در طول موج ۵۹۰ نانومتر بازتاب می‌یابد. این طول موج در گستره روشنایی سرخ نارنجی پرتویی آشکار می‌باشد که می‌توان آن را دید. برای انجام این کار مقدار ۳ میکرو لیتر دیانای و ۲ میکرولیتر بافر بارگذاری^[۵۴] را روی کاغذ پارافیلم با هم مخلوط کرده و داخل چاهک ژل آگارز قرار داده شد. بعد از بار گذاری تانک الکتروفورز را به یک منبع الکتریکی وصل کرده و ولتاژ دستگاه را روی ۸۵ ولت تنظیم شد. نمونه‌ها به مدت ۶۰ تا ۹۰ دقیقه درون ژل آگارز موجود در تانک در حرکت بودند. سپس ژل را از داخل تانک الکتروفورز برداشته و به مدت ۵ دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و جهت مشاهده باندها و تعیین کیفیت دیانای، از دستگاه ژل داک استفاده شد. اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری در جدول ۳-۱ نشان داده شد (لی و همکاران، ۲۰۱۲).

جدول ۳-۱ اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری

۳-۵ تعیین غلظت DNA استخراج شده با بهره گرفتن از اسپکتوفتومتر
برای بررسی غلظت DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده شد. برای این منظور ابتدا میزان رقت DNA مشخص شد (مثلاً ۱۰۰ برابر یا بیشتر). دستگاه برای دو طول موج ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر تنظیم و به تعداد نمونه لوله استریل در آماده شد. با توجه به حجم کووت دستگاه و میزان رقت در لوله‌ها از بافر TE یا آب مقطر استفاده و DNA مورد نیاز به لوله‌ها اضافه شد (با توجه به ضریب رقت). ابتدا دستگاه با بافر TE یا آب مقطر کالیبره شد. لوله حاوی DNA رقیق شده چند بار وارونه شد. کووت دستگاه که برای بررسی غلظت DNA از آن استفاده می‌شود با بافر TE یا آب مقطر شسته می‌شود. DNA رقیق شده موجود در لوله را در کووت دستگاه قرار داده و OD های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر به اضافه نسبت دو طول موج یاداشت شد (OD₂₆₀ مربوط به جذب DNA و OD₂₈₀ مربوط به جذب پروتئین می‌باشد). اگر این نسبت کمتر از ۸/۱ باشد نشان دهنده آلودگی با پروتئین و یا دیگر ناخالصی‌ها می‌باشد و اگر این نسبت بیشتر از ۲ باشد نشان دهنده آلودگی DNA با RNA است. برای به‌دست آوردن غلظت DNA مورد نظر از فرمول زیر استفاده شد.
ضریب رقت
*عدد بدست آمده غلظت DNA استخراج شده بر حسب نانو گرم بر میکرو لیتر می‌باشد که بسته به مقدار نیاز در واکنش PCR از آن استفاده می‌شود.
۳-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
۳-۶-۱ پروتکل و مواد استفاده شده در PCR
مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز برای نشانگر استفاده شده در این تحقیق در جدول ۳-۲ نشان داده شد:
جدول ۳-۲ مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز