وبلاگ

جدول۴-۱۷.شاخص های آمار توصیفی برای اهمیت کیفیت اطلاعات در زمینه استناد از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی

جدول۴-۱۸. آزمون t تک نمونه‌ای برای مقایسه میانگین نمونه و میانگین نظری اهمیت کیفیت اطلاعات مقاله در زمینه استناد

فصل پنجم: بحث، نتیجه‌گیری و پیشنهاد‌ها
۵-۱. مقدمه
همان گونه که در فصل اول اشاره شد، هدف اصلی از انجام پژوهش حاضر شناسایی شاخصهای اعتبار در ارتباطات علمی از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی است. در راستای رسیدن به این هدف و با توجه به این که در حوزه اعتبار، پژوهشی به طور اخص در این زمینه در حوزه ارتباطات علمی تا جایی که محقق جستجو نموده است یافت نشد پژوهشهایی که تا حدی ارتباط موضوعی با این پژوهش داشتهاند مورد بررسی قرار گرفتند و با توجه به نوع پژوهش، روش مناسب انتخاب برای اجرای آن به کار گرفته شد و در نهایت یافته های بدست آمده از بررسی انجام شده در راستای هدف پژوهش در فصل چهار ارائه شد. پس از طی مراحل یاد شده، آنچه در این فصل آورده میشود پاسخ به پرسشهایی است که در فصل یک مطرح شدهاند. پاسخها بر اساس یافته های آورده شده در فصل چهار ارائه میشوند.
۵-۲. خلاصهای از یافتهها
اولویتهای اصلی اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی در معتبر دانستن اطلاعات در زمینه مطالعه شامل ارتباط موضوعی مقاله به حوزه کاری فرد، دقت و درستی محتوای مقاله و منطقی بودن استدلالهای نویسنده در مقاله است که در اولویت اول تا سوم قرار دارند و کشور نویسنده (آیا متعلق به کشور پیشرفته است) در اولویت آخر قرار دارد. در زمینه استناد و استفاده از اطلاعات مقاله اولویت های اول تا سوم در معتبر دانستن اطلاعات شامل دقت و درستی محتوای مقاله، ارتباط موضوعی مقاله به حوزه کاری فرد و معتبر بودن داده های به کار گرفته شده در مقاله در نظر گرفته شده است و شیوه دریافت مقاله (سایت کتابخانه، وب سایت ناشر، موتورهای جستجو و…) در اولویت آخر قرار دارد. در زمینه دسترسی آزاد به مقالات، عواملی که باعث معتبر دانستن مقالات دسترسی آزاد میشود شامل موارد زیر هستند که در اولویت اول تا سوم از نظر اعضای هیئت علمی قرار دارند: برخورداری از فرایند داوری به خوبی، محتوای خود مقاله و داشتن نویسنده معتبر و مشهور. همچنین نتایج پژوهش نشان داد که اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی کیفیت اطلاعات را شاخص مهمی در اعتماد خود به مقالات هم در زمینه مطالعه و هم در زمینه استناد دانستهاند.
۵-۳.پاسخ به پرسشهای پژوهش
۵-۳-۱. شاخص های اعتبار در ارتباطات علمی در زمینه مطالعه از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی کدامند؟
نتایج آزمون ارائه شده در فصل۴، نشان میدهد تفاوت معنیداری بین میانگین نمونه و میانگین جامعه (نظری) وجو د دارد و با اطمینان ۹۵% میتوان گفت که میانگین نمونه بزرگتر از میانگین جامعه است. در نتیجه با توجه به جدول (۴-۷) مؤلفه های اعتبار علمی نویسنده، ارتباط موضوعی مقاله به حوزه کاری فرد، شهرت و اعتبار مجله، تعداد استنادهای دریافتی مقاله، توصیه مثبت یکی از دوستان یا همکاران در مورد مقاله، نمایه شدن مجله در نمایه های معتبر(ISI,Scopus,..)، ضریب تأثیر مجله، دقت و درستی محتوای مقاله، معتبر بودن داده های به کار گرفته شده در مقاله، منطقی بودن استدلالهای نویسنده در مقاله، مناسب بودن گرافیکها (تصاویر، جداول و نمودارها) شاخصهای اعتبار در ارتباطات علمی در زمینه مطالعه از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی قلمداد میگردد و این مؤلفه ها مواردی هستند که اساتید در ارزیابی اعتبار یک مقاله درنظر می گیرند و بر اساس این موارد مقاله مورد نظر را معتبر میپندارند. مؤلفه های کشور نویسنده (آیا متعلق به کشور پیشرفته است) با مقدارt(333/2-)، وابستگی سازمانی نویسنده (آیا به دانشگاه معتبر تعلق دارند) با مقدار t (794/1-) و شیوه دریافت مقاله (سایت کتابخانه، وب سایت ناشر و موتورهای جستجو و…) با مقدار t (683/.-) از نظر اساتید شاخص قلمداد نشده است و جز مؤلفه های ارزیابی اعتبار مقاله شناخته نشده است ولی با این وجود و با توجه به مقدار به دست آمده از آزمون، شیوه دریافت مقاله نسبت به دو مؤلفه دیگر تأثیر بیشتری در معتبر دانستن اطلاعات از نظر اساتید دارد و پس از آن وابستگی سازمانی نویسنده و در آخر کشور نویسنده نقش داشته است.
۵-۳-۱-۱. شاخصهای اعتبار در ارتباطات علمی در زمینه مطالعه از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی از چه اولویتی برخوردار هستند؟
بر اساس نتایج نتایج آزمون فریدمن جدول (۴-۸) و با توجه به سطح معنیداری ۰۵/. شاخصهای اعتبار در ارتباطات علمی از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی در اولویتهای متفاوتی قرار داند و از این بین مؤلفه های ارتباط موضوعی مقاله به حوزه کاری فرد، دقت و درستی محتوای مقاله، و منطقی بودن استدلالهای نویسنده در مقاله در اولویتهای اول تا سوم قرار دارند. همچنین مشاهده شد مؤلفه های معتبر بودن داده های به کار گرفته شده، اعتبار علمی نویسنده، شهرت و اعتبار مجله، نمایه شدن مجله در نمایه های معتبر، ضریب تأثیر مجله، مناسب بودن گرافیکها (تصاویر، جداول و نمودارها)، توصیه مثبت یکی از دوستان یا همکاران در مورد مقاله، تعداد استنادهای دریافتی مقاله، شیوه دریافت مقاله، وابستگی سازمانی نویسنده و کشور نویسنده به ترتیب در اولویتهای چهارم تا چهاردهم اعضای هیئت علمی درارزیابی اعتبار اطلاعات در زمینه مطالعه است.
۵-۳-۲. شاخصهای اعتبار در ارتباطات علمی در زمینه استناد از دیدگاه اعضای هیئت علمی دانشگاه خوارزمی کدامند؟

آزمایش Eijkam روش مفیدی را برای شناسایی فراهم می‏کند و ارگانیسمی که در دمای ۴۴ درجه سانتی گراد در آبگوشت مکانکی محتوی صفرا و لاکتوز تولید باز می کند‏ مقدمتاً به عنوان باکتری ‏اشریشیاکلی‏ قلمداد می‏گردد (بزرگمهری وهمکاران۱۳۷۷).

شکل ۴-۱ : ساختار باکتری اشریشیاکلی
۱-۳۶ آنتی ژن های اشریشیاکلی
۱-۳۶-۱ آنتی ژن o یا سماتیک
یک کمپلکس پلی ساکاریدی- فسفولیپیدی می باشد و زمانی آزاد می‏شود که سلول دستخوش تجزیه می‏شود. آنتی ژن o بخش آنتی ژنتیکی LPS می‏باشد و لیپیدA نیز بخش توکسین مولکول را تشکیل می‏دهد. آگلوتینه کردن آنتی ژن o در تیترهای بالا (به طور معمول بالای ۱:۲۵۶۰ )در ۵۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت اتفاق می افتد.
این آنتی ژن در پیکره باکتری قرار دارد و مقدار آن در غشاء باکتری بیشتر است ، این آنتی ژن به حرارت مقاوم بوده و حتی در حرارت ۱۰۰تا۱۲۱درجه سانتی گراد کاملاً مقاومت می نمایند. ( ۲۰۰۸ Barnes et al , Quinn )
این ترکیب پیچیده آنتی ژن توکسین داخلی باکتری یا آندوتوکسین نامیده می شود.آنتی ژنo در سویه‏های با پرگنه صاف وجود دارد .با توجه به این که این ترکیب لیپوپلی‏ساکاریدی در تمام سویه‏ها چه بیماری زا و چه غیر بیماریزا یافت می شود لذا تمایز سویه های بیماریزا از غیر بیماری زا را با مشکل مواجه می سازد. ولی آن چه که تا‏کنون محرز شده این است که سویه‏های اشریشیاکلی که در انسان و حیوانات بیماری‏زا بوده‏اند، عموماً دارای ویژگی سرولوژی مشخص و معین می باشند، به طوری که تعدادی از اشریشیاکلی‏های جدا شده از موارد کلی باسیلوز کشنده و حاد گوساله‏ها با سروتیپ مشخص و معین شامل:
سروتیپ های۱۵O_86O_114O_78O
و یا سروتیپ های آنترو توکسی ژنیک اشریشیاکلی شامل :
سروتیپ های ۱۵O_55O_26O_86 _ O101O میباشد تاکنون تعداد ۵۸ آنتی ژن O(157O_1O)یافت شده است (۱۹۶۵، Clive and Gay).
۱-۳۶-۲- آنتی ژن Hیا تاژک
جداسازی این آنتی ژن بایستی تحت شرایطی باشد که امکان حرکت باکتری را افزایش دهد آنتی ژن‏های H پرو تئین‏های هستند که در انواع مختلف تاژک‏ها یافت شده اند حرارت ۱۰۰درجه سانتی گراد آنها را نابود می‏کند .تست آگلو تیناسیون داخل لوله در۵۰ درجه سانتی گراد در مدت ۲ ساعت قرائت می شود‏( ۲۰۰۸ Barnes et al , Quinn ).
این آنتی ژن شامل ترکیبات موجود در تاژک باکتری بوده و مقدار آن در اشریشیا‏های متحرک بیشتر است. این آنتی ژن نسبت به حرارت حساس است و در دمای ۱۰۰درجه سانتی گراد غیرفعال می گردد و تاکنون تعداد ۵۲ نوع از این آنتی ژن شناسایی شده است (مهر صفت۱۳۶۳).
۱-۳۶-۳- آنتی ژن K یا کپسولی
روی سطح سلول قرار دارند و در۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۱ ساعت محو می‏شوند برخی سویه‏ها نیاز به حرارت ۱۲۱درجه سانتی گراد به مدت ۵/۲ ساعت دارند. تیترهای آگلوتیناسیون داخل لوله به وسیله مخلوط آنتی ژن – آنتی بادی در ۳۷ درجه به مدت ۲ ساعت و در مدت یک شب در ۴ درجه سانتی گراد تعیین می‏شوند تیترها بین ۱:۴۰۰ تا۱:۱۰۰ میباشند ( ۲۰۰۸‚ al et Barnes).
آنتی ژن کپسولی اشریشیاکلی از نظر خواص سرولوژی شامل یک دسته از آنتی ژن هایی است که در آن می‏‏توان سه نوع مختلف را تشخیص داد. این سه نوع عبارتنداز آنتی ژن هایA،BوL که بر حسب ویژگی‏های فیزیکی از یکدیگر متمایز می گردند. تمام آنتی ژن های کپسولی شناخته شده اشریشیاکلی به صورت پوشش غلاف یا کپسول اطراف باکتری را فرا گرفته اند .معمولاً آنتی ژن کپسولی حاوی یکی از انواع آنتی ژنA،BوL به تنهایی است اما اوروسکوف(Oroskove)وهمکارانش در۱۹۶۱برای اولین بار یادآور شدند که در بعضی از سویه‏های اشریشیاکلی آنتی ژن B و L تواماً وجود دارد که ترکیبی از اسید پلیمریک می باشد (نوروزی،۱۳۸۲).
۱-۳۶-۴- آنتی ژن F یا پیلی
این آنتی ژن باعث چسبیدن باکتری به سلول ها می‏شود به دو نوع حساس به مانوز و مقاوم به مانوز تقسیم می‏شود .آنتی ژن خارها یا فیمیریه هاست. این خارها در اطراف پیکره باکتری قرار گرفته اند که تعداد آنها برحسب نوع باکتری بین۱۰۰-۲۰۰ عدد می باشند( ۲۰۰۸‚ al et Barnes).
۱-۳۶-۵- دیگرآنتی ژن های اشریشیاکلی
الف) آنتی ژنR : که در اشریشیاکلی‏هایی که پرگنه زبر و خشن تولید می کنندیافت می شود.
ب) آنتی ژن M : این آنتی ژن در اشکال موکوئیدی سویه‏های اشریشیاکلی مشاهده می شود.
ج) آنتی ژن آلفا : این آنتی ژن در سویه‏هایی که تازه از موارد بیماری جدا شده اند یافت می شود و در کشت‏های بعدی این آنتی ژن از بین می رود.این آنتی ژن در قدرت بیماریزایی باکتری تأثیری ندارد.
د)آنتی ژن بتا : از آنتی ژن های H، O، B ،A و آلفا متمایز است و تولید یک نوع آگلوتیناسیون مخصوص که بین آگلوتیناسیون OوH قرار دارد می نماید .
۱-۳۷ طبقه بندی سویه های اشریشیاکلی
در مناطق مختلف جغرافیایی فرق می کند اما در بیشتر مطالعات سروتیپ‏های معمول بیماری‏زا ۳۵O،۳۶O،۷۸O،۲O،۱O بوده اند. یک سروتایپ ویژه نیز وجود دارد بنام ۱۱۱O که باعث مرگ، سپتی سمی و پلی سروزیت در مرغ‏های تخمگذار می شود . چندین نمونه جداسازی شده از پرندگان بیمار نیز به۵ سروتایپ زیر تعلق داشتند:
(۱۳۲O،۱۱۶O،۱۱۵O،۸۱Oو۱۸O) که بطور آشکار مربوط به کلی باسیلوز نبوده اند ( ۲۰۰۸‚ al et Barnes، ۲۰۰۲Davies&yWra).
بیماری هایی که در اثراشریشیاکلی در طیور ایجاد میشوند شامل:
۱- آرتریت و تنوسینویت
۲- عفونت کیسه زرده
۳- تورم بند ناف
۴- کلی باسیلوز سپتی سمیک
۵- پریتیونیت زرد‏ه‏ای
۶- تورم مجرای تخم بر (Salpangit )
۷- پان آفتالمیت ( Pan Aphtalemit )
۸- سندروم تورم سر (Swelling Head Syndrom )
۹- بیماری کلی گرانولوما (Coli Granoloma )
۱۰- پنومونی های چرکی
۱۱- سلولیت زیر جلدی (Swelling Cell subcutaneous )، (Saif & Jordan)
۱-۳۸ علایم کلینیکی آرتریت - تنوسینوویت
زمانی که مفاصل یا استخوان های یک پا درگیر می شوندپرندگان با مشخصه لی لی رفتن یا روی یک پا راه رفتن دیده می شود که این به خاطر آن است که فشار و وزن بدن از روی پای درگیر برداشته شود. پرندگانی که در هر دو پایشان زخم و جراحت دارند در راه رفتن یا ایستادن دچار مشکل اساسی هستند زمانی که مهره‏های تراکولومبار درگیر می‏شوندپشت پرندگان حالت قوسی پیدا می کند و روی زانو می‏نشینند گهگاهی نیز روی قسمت انتهایی تکیه کرده و پاهایشان را از روی زمین بلند می کنند( ۲۰۰۸‚ al et Barnes).
لوکالیزاسیون اشریشیاکلی در استخوان ها و بافت های سینوویال معمولاً متعاقب کلی سپتی سمی اتفاق می‏افتد واژه استئوآرتریت زمانی استفاده می شود که مفصل دچار التهاب شده و یک یا بیشتر استخوان‏های ساختمان مفصل استئومیلیت دارند.پلی آرتریت مربوط به درگیری بیش از یک مفصل می باشد.نکروز کند‏روئیت‏ باکتریایی به همراه استئومیلیت (BCO) نام دیگری است که استفاده شده است .پرندگان درگیر مقاومت ناکافی برای پاکسازی کامل باکتری ها دارند منتشر شدن اشریشیاکلی توسط جریان خون متعاقب عفونت ویروسی آنتریت هموراژیک بوقلمون در سینوویت ، استئومیلیت و تغییر رنگ کبد به رنگ سبز به نتیجه رسیده است .در یک تحقیق در گروهی از بوقلمون های تجاری که ۱۱-۸هفته سن داشتند لنگش بطور تجربی به همراه تورم مفاصل دیده شد.جوجه های درگیر دچار سینوویت ،زخم های مکرر در کبد متورم و سبز رنگ بودند. سروتایپ های مختلف اشریشیاکلی از زخم ها جداسازی گردید .از این سرو تایپ ها ۳ سروتایپ به طور داخل وریدی به جوجه بوقلمون‏های ۷ هفته سن تلقیح شدکه منجر به ایجاد سینوویت و کبدهای متورم در عرض ۳ روز بعد تلقیح گردید (۱۹۹۶ ،al et Dreoual).
تلقیح داخل وریدی جهت شبیه سازی انتشار از طریق خون باکتری به استخوان و مفاصل برای دوباره تولید کردن زخم و جراحات استفاده می شود اما مرگ و میر ناشی از آن از سپتی سمی اول اغلب بیشتراست
(۲۰۰۸‚al et Barnes).
یک دوز برتر جهت تلقیح به کیسه هوایی پرندگان با مقدار کمتر اشریشیاکلی بعد از یک پیش درمان با دگزامتازون می باشد. التهاب لایه نازک زیر بافت شاخی (لنگش) به صورت ملایم تا شدید و با رشد ضعیف به طور بالینی در پرندگان در گیر که دست خوش آزار و اذیت می شوند، دیده می شود (کانی بالیسم). باکتریها در شاخه های رگدار کلنیزه می شوند و به آسانی رشد یک استخوان را مورد تهاجم قرار میدهند و آنرا تحریک به پاسخ التهابی می کنند که به صورت استئومیلیت مشخص می شود. رگهای خونی را بعنوان مجاری بکار می گیرند تا فرایند انتشار به داخل مفاصل صورت گیرد و بافت نرم محاصره شود‏ (۲۰۰۸‚al et Barnes).
در بوقلمون های لنگان موارد زیر دیده می شود :

۱-۵ گندزدایی سطحی ریزنمونه ها
با توجه به نمودار۱-۴، مطلوب ترین تیمارها برای گندزدایی بذور گیاه گل بنفشه رقمL. Viola odorata، تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود. بذرهای گیاهی به طور طبیعی با آلودگی همراه می­باشند. کاربرد ترکیبات ضدعفونی کننده مانند الکل اتیلیک و هیپوکلریت سدیم موجب کاهش آلودگی‏های سطحی ریزنمونه می­ شود ولی تاثیر چندانی بر عوامل آلوده کننده داخلی اندام گیاهان ندارند (دانشور، ۱۹۹۲). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) برای ضدعفونی اولیه ریزنمونه های دمبرگ ابتدا به مدت ۱۰-۵ دقیقه ریزنمونه ها را با مایع ضد­عفونی کننده (پریل ۵%v/v) پیش تیمار شدند و سپس دو تا سه مرتبه با آب جاری شستشو دادند. برای ضد عفونی مرحله اصلی از الکل اتیلیک ۷۰ درصد و هیپوکلریت سدیم استفاده شد. کاربرد الکل اتیلیک بین۳۰ ثانیه تا ۶۰ ثانیه در کاهش آلودگی بذرهای گل بنفشه موثر بود. برای ضد عفونی سطحی مواد گیاهی معمولا از الکل اتیلیک ۷۰ درصد استفاده می شود، زیرا الکل اتیلیک ۹۶ درصد باعث دهیدراته شدن بافت گیاهی می شود. الکل اتیلیک تنها بخشی از میکروارگانیسم ها را از بین می­برد و بعد از آن باید یک ضدعفونی کننده دیگر مثل هیپوکلریت سدیم یا کلسیم استفاده شود. الکل اتیلیک لایه کوتیکولی سطح ریزنمونه را در خود حل نموده و موجب جذب بهتر ماده ضدعفونی می­ شود. هیپوکلریت سدیم در واکنش با آب، کلر آزاد می­ کند که موجب بهم زدن ساختار سلولی میکروارگانیسم­ها می­ شود. (اثنی عشری و زکایی خسروشاهی، ۱۳۸۸). نعیم و همکاران (۲۰۱۳) برای ضد عفونی ریزنمونه­های گیاهی برگ، ساقه و دمبرگ گیاه گل بنفشه رقم Viola odorata از الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱ دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۸ تا ۱۰ دقیقه استفاده کردند. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) ریزنمونه‏های دمبرگ گیاه Viola patrinii را به مدت ۲ تا ۳ دقیقه در الکل اتیلیک ۸۰ درصد فرو بردند و برای شستشوی سطحی از کلرید جیوه ( (HgCl₂1/0 درصد ۲ الی ۳ دقیقه استفاده کردند.

نتایج اثر نوع تیمار گند زدایی نشان داد که کمترین درصد آلودگی (صفر درصد) در تیمارهای سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵ دقیقه ) مشاهده شد و بیشترین درصد آلودگی (۴۰ درصد) مربوط به تیمار اول (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۳دقیقه) بود (نمودار۱-۴). آتسوشی و همکاران (۲۰۰۲) گزارش دادند که برگ‌های نابالغ Viola odorata را با الکل اتیلیک ۷۰% به مدت یک دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۱ درصد به مدت ۱۵ دقیقه برای گندزدایی ریزنمونه­ها استفاده کردند.
۲-۵ جوانه زنی بذر
در بررسی غلظت های مختلف MS بر درصد جوانه زنی بذرها، آنالیز داده ها نشان داد که در غلظت ۱۰/۱ محیط کشت MS، بهترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۸۸ درصد اتفاق افتاد درصورتی که در محیط کشت MS کامل، کمترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۳۷ درصد مشاهده شد (نمودار ۲-۴). طبق این نتایج مشخص شد که با کاهش غلظت عناصر محیط کشت MS، رشد و جوانه زنی بذرها بهتر شد. همچنین مشاهده شد که به احتمال زیاد به دلیل بالارفتن غلظت عناصر محیط کشت و افزایش بیش اندازه نمک، پتانسیل آب کاهش یافته و دریافت آب و مواد غذایی توسط بذر دچار مشکل گردیده که در نهایت درصد جوانه زنی پائین آمده است. از طرف دیگر، به دلیل اینکه بذرهای گل بنفشه دارای خفتگی طولانی هستند، این پائین بودن غلظت عناصر می تواند به عنوان عامل تحریک جوانه­زنی بذرهای گل بنفشه باشد. جیان و من (۲۰۰۶) نیز برای جوانه زنی بذرهای گیاه Viola wittrockiana از محیط کشت MS با غلظت پائین استفاده کردند. آن ها در محیط کشت MS، ۴/۱ غلظت بذرها را رشد دادند.
در بررسی درصد جوانه زنی بذرهای گل بنفشه مشخص شد که بیشترین درصد جوانه زنی (۶۰درصد) در تیمار MS 1/10 قدرت همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر جیبرلین مشاهده شد (نمودار۳-۴). بذرهای بنفشه دارای خفتگی طولانی است بنابرین جوانه­زنی آن­ها کند است (زاهور و همکاران، ۲۰۱۲). جیبرلین از جمله تنظیم کننده­ های رشد است که در شکستن دوره خواب بذر نقش دارد. غلضت بالای جیبرلین در بذر، خواب بذر را شکسته و جوانه زنی آن را آسان می‏کند (پیریک،۱۹۷۶). تحقیقات نشان داده است که تنظیم کننده­ های رشد مثل جبرلین، به تنهایی یا در ترکیب با کاینتین باعث افزایش درصد جوانه زنی Viola odorata شدند (کانت لیف^[۲۵]، ۱۹۹۱و کارپنتر و بوچر^۲،۱۹۹۱). بهات و همکاران^۳ (۲۰۰۵) نشان دادند که گیاه مریم کوهیSwertia angustifoli از خانواده Gentianaceae با کاربرد جبرلین، جوانه زنی آن را تا ۹۶ درصد افزایش داد و کاهش میانگین طول دوره جوانه زنی را به دنبال داشت. در این آزمایش مشخص شد که جیبرلین در جوانه­زنی بذور تاثیر مثبت داشت که با نتایج بدست آمده همخوانی داشت.
دربررسی اثر شرایط نوری بر درصد جوانه زنی گیاه گل بنفشه دیده شد که بیشترین درصد جوانه زنی بذرها مربوط به تیمار تاریکی با ۵/۵۲ درصد بود (نمودار۴-۴). بعضی از بذرها برای جوانه زنی نیاز به تاریکی دارند که این در بذر کاهو و چند دسته دیگر از گیاهان مشاهده شده است. بنفشه نیز از جمله گیاهانی است که برای جوانه زنی بهتر باید در معرض تاریکی باشد که نتایج حاصله نشان دهنده این نکته می­باشد (حکمتی، ۱۳۸۲).
۳-۵ تولید کالوس
در بررسی تولید کالوس از ریزنمونه های برگ، دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد NAA به همراه BAP، مقدار بسیار کمی کالوس همراه با ریشه‏های فراوان تولید کردند و یا هیچ گونه کالوس تشکیل نگردید. برای تشکیل کالوس یک نسبت معین از اکسین به سایتوکنین مثلا ۱۰ به ۱ نیاز می­باشد و حفظ این تعادل در القاء و تشکیل کالوس حائز اهمیت است (دانشور، ۱۹۹۲). هورمون NAA از جمله اکسین­های قوی است. احتمالا به علت قوی بودن این هورمون و به هم خوردن تعادل نسبت اکسین به سایتوکنین، و بالا رفتن بیش اندازه غلظت اکسین در محیط کشت، القاء کالوس زیاد موفقیت آمیز نبود. جیان و من (۲۰۰۶) بیان کردند که کالوس‏های گیاه بنفشه بعد از تشکیل خیلی سریع ریشه می‏دهند. از آنجایی که هورمونNAA از جمله هورمون‏های موثر در ریشه زایی است، همان مقدار کالوس تشکیل شده اولیه، بلافاصله شروع به تولید ریشه کرده و روند کالوس زایی متوقف می‏شود. همچنین در نتیجه ای که توسط کومار و کانوار ^[۲۶] (۲۰۰۶) در همین زمینه انجام شده است. آن‌ ها مشاهده کردند که کالوس‌های برگ گیاه ژربرا درمحیط کشت دارای NAA ریشه دار شدند. همچنین گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند در غلضت‏های بالای NAA و BAP هیچ پاسخی در برابر تشکیل کالوس مشاهده نکردند. این آزمایش با آزمایش اسوات و چادهاری^[۲۷] (۲۰۰۲) مطابقت نداشت، آن­ها بیشترین کالوس را از برگ­های ژربرا در محیط کشت MS همراه با هورمون‏های NAA و BAP بدست آوردند.
در بررسی القاءکالوس گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد ۲,۴-D به همراه BAP، بیشترین وزن کالوس (۵۴/۰ گرم) در محیط کشت MS حاوی ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D تولید شد. و بعد از آن در محیط کشت MS همراه با ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBPA بیشترین وزن کالوس (۴۵/۰ گرم) حاصل گردید (نمودار۵-۴). نتایج نشان دادند که با کاهش میزان ۲,۴-D میزان تشکیل کالوس کاهش یافت. همچنین مشاهده شد در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد، کالوس تشکیل نشد. این نتایج نشان داد که در تشکیل کالوس وجود اکسین ضروری است و در محیط‏های کشت بدون اکسین، کالوس تشکیل نمی­ شود. این نتایج با نتایج آتاک و سلیک^[۲۸] (۲۰۰۹) مطابت داشت. آنها به تولید کالوس از برگ‏های ژربرا با بهره گرفتن از ترکیب هورمون ۲,۴-D وBAP دست یافتند. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که اکسین برای بالا بردن القاء کالوس لازم است و هورمون ۲,۴-D اثری بیشتری در تشکیل کالوس نسبت به IBA داشت. آن‏ها در محیط کشت MS با ۵/۰ میکرومول در لیتر ۲,۴-D + 9/8 میکرومول در لیتر BAPبه ۱۰۰ درصد تشکیل کالوس رسیدند و عنوان کردند که غلضت بالای BAP اثر بازدارنده بر تشکیل کالوس دارد.
در بررسی نتایج نوع ریزنمونه بر وزن کالوس تشکیل شده از گیاه گل بنفشه مشاهده شد، نوع ریزنمونه در نتایج تولید کالوس موثر است و بیشترین وزن کالوس (۴۶/۰ گرم) از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد. (نمودار۶-۴ الف). نتایج این آزمایش با نتایج آزمایش گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) مطلابقت داشت. آن­ها بیشترین وزن کالوس تولید شده را از ریزنمونه دمبرگ Viola patrinii دریافت کردند. همچنین نتایج نشان داد، کمترین میزان تشکیل کالوس از ریزنمونه برگ حاصل شد. جیان و من (۲۰۰۶) هر چند که تفاوت معنی داری در میزان کالوس حاصل از ریزنمونه‏های برگ و دمبرگ Viola wittrockiana مشاهده نکردند ولی گزارش دادند که کالوس‏های حاصل از برگ قهوه ای و کم حجم بودند که تولید ریشه می‏کردند و از نظر کیفی نسبت به کالوس‏های دمبرگ ضعیف­تر بودند.
نتایج اثر برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت القاء کالوس نشان داد که بیشترین میزان کالوس (۷۶/۰ گرم) در محیط کشت MS همراه با ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBPA از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار۶-۴ب). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) بیشترین وزن کالوس تولیدی را از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشتMS همراه با ۴۴/۱۳ میکرومول در لیتر NAA + 33/13 میکرومول در لیتر BA بدست آوردند. نعیم و همکاران گزارش دادند که نتایج القاء کالوس در ریزنمونه‏های برگ، دمبرگ و ساقه Viola odorata متفاوت بود.
۴-۵ باززایی از کالوس
یکی از عوامل مهم برای ایجاد یک باززایی موثر و موفقیت آمیز، تشکیل و تولید کالوس باکیفیت به مقدار مناسب است. کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه در مرحله اول کشت دارای کیفیت و انسجام ساختاری ضعیفی می­باشند که باید برای رشد بیشتر و کیفیت بهتر زیر کشت شوند. شرایط لازم برای رشد کالوس (محیط رشد، عوامل فیزیکی موثر در رشد) معمولا مشابه با شرایط لازم برای القای تشکیل کالوس می­باشد، با این تفاوت که غلضت اکسین و سیتوکنین کمتر است (پیریک،۱۹۷۶). به همین دلیل کالوس‏های حاصل از اولین مرحله کشت، به محیط کشت­های جدید زیرکشت شدند. این عمل زیر کشت ۲ بار انجام گرفت. محیط‏های کشت جدید حاوی ۲۵/۰ میلی گرم در لیتر IBA بودند. نتایج نشان داد که کالوس­های تولیدی بعد از زیر کشت شدن، دارای توانایی باززایی بالاتری نسبت به کالوس­های زیر کشت نشده بودند. زانگ و همکاران ^[۲۹](۱۹۹۳) و فانگ و همکاران^۲ (۲۰۰۰) به این نتیجه پی بردند که زیرکشت دوم روی کالوس برای باززایی موفقیت آمیز خواهد بود. همچنین نجیب و همکاران (۲۰۰۹) عنوان داشتند که زیرکشت کردن برای توسعه کالوس ها و باززایی شاخساره لازم است. جیان و من (۲۰۰۶) در باززایی بنفشه از کالوس گرفته شده از دمبرگ متوجه شدند که زیر کشت، برای باززایی شاخساره خیلی اهمیت دارد. آن­ها با مقایسه کالوس‏هایی که زیرکشت شدند بودند و کالوس‏هایی که بدون زیر کشت به محیط باززایی منتقل شده بودند، مشاهده کرند کالوس‏های زیر کشت نشده، بعد از انتقال به محیط کشت باززایی، ریشه دادند و باززایی شاخساره موفقیت آمیز نبود. نتایج مشابهی در بعضی از گونه‏های گیاهی توسط اسریکاندراج و همکاران^[۳۰]، ۱۹۸۲و گاریران و همکاران^۲، ۱۹۹۹ گزارش شده است.
۱-۴-۵ آزمایش اول باززایی
نتایج اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین تعداد شاخساره (۹۴/۲ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم TDZ به دست آمد (نمودار ۸-۴). TDZ نسبت به سایرسایتوکنین‏هایی که استفاده شد خیلی قوی­تر عمل می­ کند (ناگنت و واردلی ریچاردسون،۱۹۹۱^۳). ساجید و فهیم^۴ در سال ۲۰۰۹ نشان دادند که وقتی TDZ در مقدار کم به محیط کشت اضافه شود خیلی موثرتر است. شاید به همین دلیل است که مقدار ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ بهتر از مقدار ۲ میلی­گرم در لیتر TDZ در تشکیل شاخساره موثر بوده است. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که در محیط کشت MS همراه با ۵/۴ میکرومول در لیتر TDZ و ۰۲/۰ ( (w/vزغال فعال، بالاترین درصد باززایی (۹/۲۱ ٪) را به دست آوردند. در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر Kin+ 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و محیط کشت MS همراه با ۱میلی­گرم در لیتر + Kin 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP کمترین تعداد شاخساره (۱ عدد) مشاهده شد (نمودار۸-۴).
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بیشترین تعداد شاخساره (۴ عدد) با انتقال کالوس‏های تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلی­گرم در لیتر TDZ به دست آمد و بعد از آن بیشترین تعداد شاخساره (۸/۳ عدد) با انتقال کالوس‏های تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلی­گرم در لیترTDZ بود (جدول ۶-۴). نتایج نشان داد که محیط­های کشت‏ تولید کالوس همراه با اکسین و سایتوکنین، باززایی بهتری نسبت به سایر تیمارها نشان دادند. سایتوکنین­ها وقتی­که توام با یک اکسین استفاده شوند، باعث تحریک تقسم سلولی می­شوند (آماسیون^[۳۱]، ۲۰۰۵).
درمورد اثر نوع محیط کشت تولید کالوس برشاخص طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد که بیشترین طول شاخساره (۲/۴ سانتی متر) در محیط کشت MS حاوی ۱میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به دست آمد (نمودار۹-۴ الف). با توجه به نتایج بدست آمده مشخص شد در محیط‏های کشت تولید کالوس حاوی اکسین توفوردی و BAP، طول شاخساره بیشتربود. جیان و من (۲۰۰۶) گزارش کردند، BAP روی طویل شدن شاخساره‏های حاصل از باززایی موثر بود.
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین طول شاخساره (۸۲/۶ سانتی متر) با انتقال کالوس حاصل از محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ به دست آمد (جدول ۷-۴ ). این نتایج نشان داد که محیط‏های کشت تولید کالوس که علاوه بر اکسین توفوردی حاوی BAP بودند، با انتقال به محیط کشت باززایی، طول شاخساره بیشتری، تولید کردند. احتمالا افزودن سیتوکنین در مرحله تولید کالوس، باعث تجمع سایتوکنین درونی سلول­های تمایز نیافته کالوس می­ شود که موجب می­گردد، کالوس در مرحله باززایی و تولید شاخساره بهتر عمل کند.
۲-۴-۵ آزمایش دوم باززایی
بیشترین تعداد و همچنین طولانی شدن طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه از ریزنمونه دمبرگ تولیدگردید (۱۰-۴ الف). این نتایج با نتایج ساتو و همکاران (۱۹۹۵) مطابقت داشت. آن‏ها از کالوس‏های گرفته شده از دمبرگ ویولای وحشی، باززایی شاخساره انجام دادند. اورلیکوکا و همکاران^[۳۲] (۱۹۹۹) عنوان داشتند که بخشی از شاخه زایی به نوع ریزنمونه ای که کالوس از آن حاصل می‏شود بستگی دارد. آن‏ها به باززایی ۶ شاخساره از هر قطعه کالوس حاصل از دمبرگ ژربرا دست یافتند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین تعداد شاخساره (۲۳/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBAP به دست آمد (نمودار ۱۰-۴ ب). نتایج نشان داد که در محیط‏های کشت حاوی BAP، تعداد شاخساره بیشتر از سایر محیط‏های کشتی بود که فقط حاوی اکسین بودند. وجود سایتوکنین در محیط کشت بر روی شاخه زایی اثر مثبت داشت. این نتایج با نتایج نجیب و همکاران (۲۰۰۹) مطابقت داشت. آن‌ ها مشاهده کردند که افزودن BAP و توفوردی به محیط کشت موراشیک و اسکوگ، روی تولید کالوس و باززایی گیاه موثر است.
نتایج بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بیشترین تعداد شاخساره (۹۶/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA تولید شد. بعد از آن تیمار محیط کشت ۱ میلی گرم در لیترTDZ دارای بیشترین تعداد شاخساره بود (۵۶/۴ عدد) (نمودار۱۰-۴ ج). طبق این نتایج مشاهده شد که در محیط‏های کشت حاوی TDZ، باززایی با نسبت خوبی انجام گرفت و در محیط‏های بدون TDZ، باززایی با نسبت پائینی اتفاق افتاد که کمترین میزان باززایی در محیط کشت MS همراه با ۵/۰میلی­گرم در لیتر Kin + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP(58/1 عدد) صورت گرفت. (نمودار۱۰-۴ ج). این نتایج با نتایج وانگ و من^[۳۳] (۲۰۰۶) مطابقت داشتند. آن‏ها گزارش دادند موفقیت در شاخه زایی و هم چنین، طول و تعداد آن به وجود TDZ همراه با سایر هورمون‏ها بستگی دارد. هاتمن و پرس^۳ (۱۹۹۳) عنوان کردند تیدارزرون با تحریک سیتوکنین­های درون زا گیاه، موجب تحریک و شاخه­زایی در گیاه می­گردد. همچنین نتایج این آزمایش نشان داد که کاربرد اکسین NAAدر کنار TDZ تاثیر خوبی در باززایی شاخساره داشت. هازبولا و همکاران^[۳۴] (۲۰۰۸) گزارش دادند که افزودن اکسین، در کنار سایتوکنین­ها برای القای شاخساره در ژربرا لازم است.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت تولید کالوس برتعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد، بیشترین تعداد شاخساره (۷۱/۴ عدد) از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشت MS به همراه ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP تولید شد و کمترین تعداد شاخساره (۷۲/۱) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D بدونBAP اتفاق افتاد (نمودار۱۰-۴ د). زاهور و همکاران (۲۰۱۲) با محیط کشت MS همراه با ۱۵ میکرومولار BAP و ۱۵ میکرومولار Kin به بهترین نتیجه تعداد شاخساره را نشان دادند. آن‏ها مشاهده کردند که با افزایش غلظت BAP از ۵ میکرومولار به ۱۵ میکرومولار، تعداد شاخساره به طور معنی­داری افزایش یافت.
نتایج اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAPبه دست آمد. همچنین مشاهده شد، کمترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D بدون BAP صورت گرفت (نمودار ۱۱-۴ ب). این نتایج نشان داد که در محیط‏های کشت حاوی BAP، طول شاخساره نسبت به سایر محیط‏های کشت بیشتر بود. دانشور (۱۹۹۲) و لاکشمی سیت^۳ (۱۹۹۳) اثر مثبت کاربرد سیتوکنین­ها بر شاخه زایی در گیاهان مختلف را تائید کردند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بلندترین شاخساره (۲۳/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلی گرم در لیتر NAA تولید شد (نمودار ۱۱-۴ ج). این نتایج نشان داد که TDZ تاثیر خوبی بر طول شاخساره داشت. در محیط‏های دارای TDZ طول شاخساره نسبت به سایر محیط‏ها بیشتر بود به طوری­که کمترین طول شاخساره در محیط کشت بدون TDZ اتفاق افتاد. محیط کشت MS همراه با۱ میلی­گرم در لیتر Kin + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP کمترین طول شاخساره ( ۴۶/۱ سانتی­متر) داشت. سونی و کور^[۳۵] (۲۰۱۳) گزارش دادند حضور ۵/۰ میلی­گرم در لیتر TDZ در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر BAP و ۵/۰ میلی­گرم در لیتر جیبرلین، تاثیر خوبی در تشکیل شاخساره از جوانه­های Viola pilosa داشت.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت باززایی برطول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نیز مشاهده شد، بیشترین طول شاخساره (۵۹/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیترTDZ + 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بود که از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار ۱۲-۴ ). در این نتایج مشاهده شد که ترکیب TDZو NAA افزایش معنی­داری در شاخه زایی از کالوس­های دمبرگ داشت که این با نتایج ناگنت و واردلی ریچاردسون ( ۱۹۹۱) مطابقت داشت. پیریک و همکاران (۱۹۷۳) گزارش دادند که افزودن یک اکسین قوی مانند NAA به محیط کشت باززایی، در تشکیل شاخساره خیلی موثر است.گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) از کالوس‏های حاصل از دمبرگ ویولای وحشی شاخساره‏های ۷-۶ سانتی تولید کردند.
نتایج برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بلندترین طول شاخساره با انتقال کالوس از محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D به محیط کشت باززایی همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر + TDZ1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بدست آمد (جدول ۱۰-۴).
۵-۵ ترکیب بهترین تیمار باززایی همراه با پوتریسین
پلی آمین ها به عنوان تنظیم کننده های رشد گیاهی در محدوده وسیعی از فرایندهای رشد و نمو، شامل تقسیم سلولی، رویان زایی و ریخت زایی مشارکت دارند (کائور-ساهنی و همکاران^[۳۶]،۲۰۰۳). پوترسین و پلی آمین‏های اسپرمیدین و اسپرمین ممکن است در تقیسم سلولی و رشد و نمو گیاه نقش داشته باشند (باگنی^۳، ۱۹۸۶، ِاوَنس و مامبرگ^[۳۷]، ۱۹۹۱، گالستون^۲، ۱۹۸۳). در این آزمایش اثر پوترسین برباززایی گیاه گل بنفشه بررسی شد. اثر پوترسین بر شاخساره نشان داد، بیشترین طول شاخساره (۱۴/۶ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم بر لیترTDZ + 100میلی گرم در لیتر پوتریسین مشاهده شد که با سایر تیمارها از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری داشت (نمودار۱۴-۴). این نتایج با نتایج تیروونگدام و همکاران^۳ (۲۰۱۲) مطابقت داشت. آن­ها وجود پلی آمین­ها در محیط کشت باززایی را موثر دانستند. بسای و متا^۴ (۱۹۸۵) نیز نقش پلی آمین­ها در باززایی شاخساره از برگ­های Passiflora sp. را تائید کردند. همچنین در این آزمایش بیشترین تعداد شاخساره در غلضت ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر پوتریسین به همراه ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ مشاهده شد که البته این با سایر غلضت‏های پوتریسین تفاوت معنی داری نداشت. (نمودار۱۳-۴).
۶-۵ ریشه زایی
در بررسی بین پنج محیط کشت ریشه زایی، بیشترین تعداد ریشه و طول ریشه در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر NAA + 1/0 میلی­گرم در لیترIBA تولید شد و کمترین تعداد ریشه در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد مشاهده شد (نمودار۱۵-۴ و نمودار ۱۶-۴). نتایج نشان داد که ترکیب هورمون NAA با IBA نتیجه بهتری در تعداد ریشه و طول ریشه داشت تا زمانی که از هورمون NAA به تنهایی استفاده شد. همچنین مشاهده شد که با افزایش غلضت هورمون NAA، تعداد ریشه بیشتری تولید شد. پیریک و همکاران (۱۹۸۴) نشان دادند که NAA سبب تسریع در ریشه دهی گیاهچه­ها در گیاهان خانواده آناناس می شود. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند که گیاهچه­های بنفشه وحشی Viola patrinii)) با محیط کشت MS همراه با IAA و IBA دارای رشد و تعداد ریشه‏های متوسطی (۶۳ درصد) تولید شد. آن­ها در محیط­های کشت حاوی فقط IAA با غلظت ۷۱/۵ و ۴۲/۱۱ میکرومول در لیتر، تشکیل ریشه قابل توجهی را مشاهده نکردند.
۷-۵ سازگاری
از بین سه نوع بستر کشت، گیاهان رشد یافته در بستر کوکوپیت و پرلیت (۱:۱) بیشترین درصد زندمانی را نشان دادند. همچنین در بستر ترکیبی کوکوپیت و پرلیت گیاهک‏ها، شاخساره‏های بلندتری تولید کردند (نمودار ۱۷-۴ و نمودار ۱۸-۴). نتایج نشان داد که مخلوط کوکوپیت و پرلیت، تاثیر مثبتی نسبت به بسترهای جداگانه آن‏ها داشت. پرلیت به دلیل تخلل خوب و زهکشی و تهویه مناسب و کوکوپیت به دلیل اینکه ظرفیت نگه داری آب بیشتری دارد. در مجموع محیط مناسبی را برای رشد گیاهان در شرایط کشت بافت بوجود آوردند. پرلایت دارای طبیعت متخلخل است که به آن توان نگهداشتن مقداری آب می دهد و اندازه ذرات آن تهویه و زهکشی خوبی فراهم می کند. از اثرات مفید کوکوپیت این است که به دلیل داشتن اندازه کوچک ذرات، قدرت نگه داری آب بیشتری دارد ولی حالت غرقاب در گیاه ایجاد نمی کند زیرا خاصیت موئینگی در این ماده بالاست و بستر به تدریج آب خود را از دست می دهد (نوگرا و همکاران^[۳۸]، ۲۰۰۰). رشد و نمو گیاه به طور موثری با دسترس بودن فسفر در ارتباط است چون فسفر باعث افزایش طول ساقه گل می شود. گیاهان رشد یافته در بستر کشت کوکوپیت و پرلیت به نسبت (۱:۱) و کوکوپیت به علت pH پایین کوکوپیت عناصر ماکرو مخصوص فسفر و پتاسیم را به راحتی جذب می­ کنند و رشد بهتری نسبت به گیاهان رشد یافته در بستر پرلیت دارند (احمد و همکاران^۲،۲۰۱۲).
۸-۵ نتایج کلی
***نتایج کلی آزمایش گندزدایی بذرهای گل بنفشه نشان داد که بهترین تیمارهای ضدعفونی کننده بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود که در هر دو تیمار درصد آلودگی بذرها صفر گزارش شد.
*** نتایج آزمایش درصد جوانه زنی نشان داد که بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata در محیط کشت همراه با جیبرلین جوانه­زنی بهتری نسبت به محیط کشت عاری از جیبرلین داشتند. همچنین تیمار تاریکی نسبت به تیمار روشنایی در جوانه­زنی بذرها موثرتر بود.
*** در آزمایش القاء کالوس نتایج نشان داد که تنظیم­کننده رشد توفوردی نسبت به NAA در القاء و تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه گل بنفشه اثر بیشتری داشت و به طور کلی تیمار ۱ میلی­گرم در لیتر توفوردی بیشترین میزان کالوس را تولید کرد. همچنین ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونه­های برگ و دمبرگ، تولید کالوس بهتری را نشان داد.
***در آزمایش باززایی گیاه گل بنفشه نشان داد که زیرکشت کردن کالوس­ها یک عامل مهم در باززایی گیاه گل بنفشه است. زیرا میزان و کیفیت کالوس تولیدی در مرحله اول کشت بسیار کم است و باید برای تولید بیشتر و با کیفیت­تر، کالوس­ها زیرکشت شوند. در این آزمایش بهترین باززایی شاخساره در محیط کشت ۱ میلی­گرم TDZ مشاهده شد و ریزنمونه دمبرگ، نسبت به ریزنمونه برگ و ساقه، باززایی بهتری را نشان داد. در ترکیب بهترین تیمار مرحله باززایی با پوترسین نیز به­ طور ­کلی بهترین باززایی در تیمار ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر پوترسین همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ مشاهده شد.
*** آزمایش ریشه زایی شاخساره­های تولیدی گیاه گل بنفشه نشان داد که ترکیب دو تنظیم کننده رشدNAA و IBA به ترتیب با غلظت­های ۱ و ۱/۰ میلی­گرم در لیتر در ریشه زایی شاخسارها، نتیجه بهتری را داشت. همچنین مشاهده شد که با افزایش تنظیم کنندهNAA تا غلظت ۱ میلی­گرم در لیتر، میزان ریشه دهی شاخساره ها افزایش یافت.
*** درسازگاری گیاهک های حاصل از ریزنمونه های گل بنفشه نتایج نشان داد، ترکیب دو بستر کشت کوکوپیت و پرلایت درصد زنده مانی بیشتر و طول شاخساره بلندتری را تا کاربرد مجزای هر یک از این بسترها، در پی داشت.
۹-۵ پیشنهادات:
***گیاه گل بنفشه یک گیاه دارویی –زینتی است و کاربرد زیادی در بحث زیباسازی مناظر شهرها دارد و از طرف دیگر در صنعت داروسازی هم از اهمیت زیادی برخوردار است، در حال حاضر، یک سوم داروهای مورد استفاده بشر را داروهای با منشاء گیاهی تشکیل می دهد. از این رو پیشنهاد می شود که آزمایش­های بیشتری در جهت تولید و تکثیر آن در حد انبوه و تجاری از طریق زمینه کشت بافت صورت گیرد تا بدین طریق میزان متابولیت­های ثانویه مانند فلاونوئیدها، آلکالوئید (ویولین)، روغن­های ضروری ( لینولنیک، هیدروکینون دی متیل اتر) و اسید سالیسلیک افزایش یابند.
***از آنجایی که در این تحقیق تنها یک رقم گیاه گل بنفشه جهت باززایی در نظر گرفته شد، پیشنهاد می شود که سایر رقم های این گونه و همچنین سایر گونه­ های جنس Viola مورد آزمایش قرار گیرند.
*** پیشنهاد می شود سایر تنظیم کننده­ های رشد اکسین و سیتوکنین در بررسی کالوس زایی و اندام­زایی آن مورد آزمایش صورت گیرد.
*** به دلیل زمان کم این پایان نامه، و پرهزینه بودن استخراج، خالص سازی و شناسایی متابولیت­های ثانویه این گیاه پیشنهاد می شود بخش دارویی این گیاه در تحقیقی دیگر مورد بررسی قرار گیرد.
منابع:
منابع:
۱-سیدطباطبایی، ب. ا. و امیدی، م. ۱۳۸۸. کشت بافت و سلول گیاهی. انتشارات دانشگاه تهران. ۳۶۸ص.
۲-ایوانز، دی.، کولمن، جی. او. دی و کرنز، ا. ۲۰۰۷. کشت یاخته گیاهی. مترجمان: محمود خسروشاهی و مهدی بهنامیان. انتشارات دانشگاه تبریز. ۲۷۷ ص.
۳-اثنی عشری، م. و زکائی خسروشاهی، م. ۱۳۸۸. راهنمای جامع کشت بافت گیاهی. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۴۸۵ص.
۴- چاولا، اچ. اس. ۱۳۸۲. اصول بیوتکنولوژی گیاهی. مترجمان: محمد فارسی و جعفر ذوالعلی. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. ۴۹۵ ص.
۵- پیریک، آر. ال. ام. ۱۹۷۶. مبانی کشت بافت‏های گیاهی. مترجم: عبدالرضا باقری. انتشارات دانشگاه مشهد. ۴۰۶ص.
۶- پیری، خ. و نظریان فیروزآبادی، ف. ۱۳۸۵. راهنمای کشت بافت گیاهان. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۲۱۴ص.
۷- فرزاد، م. ع. ۱۹۳۱. گیاهان دارویی و معطر ایران. جلد اول. ۲۶۲ ص.
۸- مظفریان، و. ۱۳۷۹. رده بندی گیاهان (مورفولوژیکی-تاکسونومی). جلد اول. انشارات امیرکبیر تهران. ۵۰۱ ص.
۹- مظفریان، و. ۱۳۹۱. شناخت گیاهان دارویی و معطر ایران. ۱۳۵۰ ص.

Opportunities

Threats & Challenges

• • اولین خدمات الکترونیکی دولتی در بسیاری استانها از جمله یزد

• • کاهش هزینه های بایگانی و رشد اقتصادی در دراز مدت

• • کاهش هزینه ها و وقتهای رفت و آمد و کاهش آلودگی

• • کاهش هزینه های پرسنلی

• • سرویس دهی بهتر و راحتر به مردم از طریق خدمات الکترونیکی

• • تکریم ارباب رجوع

• • سادگی و راحتی کار

• • افزایش امنیت و کیفیت

• • کاهش خطا و تحمل بیشتر خطای سیستم

• • کاهش برخی تخلفات به دلیل خودکار شدن سیستم

• • واکنش فرهنگی

• • مشکلات مخابراتی

• • نا امنی‌هایی ناشی از تمرکز زدایی

جدول شماره ۴- تحلیل SWOT
۷-۱ ارزیابی هزینه‌
در روشی که برای اشتراک پذیری و فروش الکترونیکی گاز در شرکت‌های گاز استانی، پیشنهاد شد، هزینه‌هایی که با مطرح شدن این روش جدای از هزینه‌های فعلی مطرح است را بررسی می‌کنیم.

قابل ذکر است که کلیه مراکز پیش‌خوان دولت و سازمان نظام مهندسی ساختمان به کامپیوترهای رومیزی، اینترنت مجهز هستند. همچنین خود شرکت گاز نیز به اینترنت پر سرعت مجهز هست. پس هزینه سخت افزارهای مورد نیاز که شامل سرور و VPN می‌شود. مشخصات کلی سرور پیشنهادی در قسمت مشخصات فنی سیستم توضیح داده شد، قیمت فعلی بازار بین ۴ تا ۸ میلیون تومان برای چنین سروری با توجه به مدل و داشتن حداقل امکانات موردنیاز برآورد می‌شود. برای تامین امنیت لازم، اکانت های VPN را با نرم افزارهای مربوطه با قیمت‌های ارزان ارائه می‌شود، به صورت تخمینی ماهیانه استفاده و پشتیبانی از چنین محیط امنی، ۲۰۰ هزار تومان هزینه در بر دارد.
در رابطه با پیشنهاد استفاده از دیناسنترها هزینه‌ها نسبت به خرید سرور کاهش می‌یابد. قیمت برآورد شده در دیتا سنتر پارس آنلاین، هزینه راه اندازی ۱۰۰هزار تومان و ماهیانه حدود ۴۰۰ هزار تومان هزینه در بر دارد. این در حالی است کلیه امنیت و پشتیبانی از خرابی‌ها و مانند آن به عهده دیتا سنتر است.
علاوه بر هزینه‌های سخت‌افزار مورد نیاز باید به هزینه‌های دیگری نیز توجه کرد. کارمندان پیش‌خوان‌های دولت علاوه بر کارهای مربوط به شرکت گاز، خدمات دیگری را نیز همچون صدور گذرنامه، برخی خدمات ثبت احوال و مانند آن را نیز انجام می‌دهند ، این در حالی است که تنها برای اشتراک پذیری گاز در یزد، دو کارمند شرکت نفت و کارمندانی که در واحد مشترکین شرکت گاز مشغول به کار هستند ( واحد مشترکین ناحیه یزد، ۱۵ کارمند تمام وقت دارد که روزانه از ساعت ۷ تا ۱۶ مشغول کار هستند) باید در طول روز تنها کارهای مربوط به شرکت گاز را انجام دهند. در صورت واگذاری این کار به پیش‌خوان‌های دولت و پیاده سازی روش پیشنهادی واحد مشترکین شرکت گاز به طور محسوسی تعدیل نیرو میگردد و تنها چند نفر برای پشتیبانی در آن واحد مستقر خواهند بود.
هزینه بایگانی اسناد و مدارک مورد نیاز، در حالت سنتی نسبت به ذخیره سازی آنها در هاردهای بزرگ به طور چشمگیری بیشتر است.
۷-۲ ارزیابی سرعت عمل
‌ برای مقاسبه سرعت روش فعلی نسبت به روش پیشنهادی باید زمان‌‌های رفت و آمد به سازمان نظام مهندسی ساختمان، شرکت نفت مرکزی و شرکت گاز را به علاوه انتظار برای پاسخگویی این سه شرکت، در نظر گرفت.
اگر مبدا حرکت از مرکز شهر یزد در نظر گرفته شود، در صورت داشتن وسیله، با توجه به ترافیک نه چندان زیاد این شهر، حداقل ۲۰ دقیقه برای رسیدن به هر سازمان زمان بر است.
دقیقه ۶۰= ۳*۲۰
اگر زمان پاسخگویی به متقاضی در شرکت نظام مهندسی ساختمان، ۱۵ دقیقه، در شرکت نفت مرکزی ۱۰ دقیقه و در شرکت گاز ۲۰ دقیقه در نظر گرفته شود:
دقیقه ۱۱۵ = ۶۰+۱۵+۱۰+۲۰
اما در روش پیشنهادی حدود ۲۰ دقیقه زمان برای رسیدن به نزدیکترین دفتر پیش‌خوان دولت، بیشتر زمان نمی‌برد. جهت پاسخگویی به درخواست نیز اگر ۱۵ دقیقه زمان نیاز باشد در مجموع ۳۵ دقیقه زمان لازم است.
دقیقه۸۰ =۳۵-۱۱۵
یعنی به طور متوسط، حدود ۸۰ دقیقه برای هر متقاضی در وقت صرفه جویی می‌شود و به سرعت امور افزوده شده است. نکته قابل توجه این‌که اگر مدارک متقاضی تکمیل نباشد و یا نقصی داشته باشد، زمان‌های رفت و برگشت به هرکدام از سازما‌ن‌ها به زمان محاسبه شده افزوده می‌شود.
۷-۳ ارزیابی سادگی و راحتی

D= -LnI
مقدار D بین صفر و بینهایت متغیر است. اگر دو جمعیت دارای فراوانی آللی مشابهی باشند، مقدار شباهت ژنتیکی بین دو جمعیت به ۱ نزدیک شده و فاصله ژنتیکی به صفر نزدیک می­ شود. در مقابل اگر دو جمعیت در هیچ آللی مشترک نباشند، I معادل صفر و D بی­نهایت خواهد بود.

۱۸-۱- ضرورت تحقیق

در طی ۲۰ سال گذشته زیست شناسی مولکولی تحولی شگرف در تحقیقات بوم­شناسی پدید آورده است. در طول این مدت استفاده از روش­های مولکولی برای شناسایی ژنتیکی موجودات، جمعیت­ها و گونه­ ها در آزمایشگاه­ها متداول گشته و توانسته است اطلاعات جدید و فراوانی را در زمینه بوم شناسی و تکامل گیاهان، جانوران، باکتری­ ها، جلبک­ها و قارچ­ها فراهم آورد. بوم شناسی شاخه­ای از زیست شناسی است که به مطالعه روابط بین گونه­ ها و برهم کنش آن­ها با محیط فیزیکی پیرامونشان می ­پردازد. فعالیت­های بوم شناسی به­خصوص در سطح مولکولی کمک شایانی به پایش ذخایر ماهیان می­ کند و با توجه به خروجی­های حاصل از اطلاعلات آن می­توان تصویر روشنی از شرایط کنونی و آینده ذخایر ماهیان متصور شد. تنوع ژنتیکی منابع دریایی اهمیت حیاتی برای مدیریت و حفاظت از آن­ها داشته و به عنوان اولین پیش­نیاز برای حفظ سازگاری جمعیت­ها در شرایط محیطی در حال تغییر محسوب می­گردد (دیز و پرسا، ۲۰۰۹). حفظ تنوع ژنتیکی گونه­ های دریایی نقش بسیار مهمی در پایداری و بقای اکوسیستم با اهمیت دریای خزر دارد. اکثر مطالعات در دریای خزر بر روی گونه­ های صرفاً اقتصادی مثل ماهی سفید، کلمه و کپور انجام پذیرفته است. شگ­ماهی براشنیکووی از راسته شگ ماهیان از جمله ماهیانی است که به فراوانی در آب­های جنوبی دریای خزر پراکنش یافته و اثر غیر­قابل انکاری بر هرم اکولوژیکی دریای خزر دارد. علی­رغم فراوانی و پراکنش گسترده شگ‌ماهیان در دریای خزر تاکنون هیچ مطالعه­ ای بر وی ژنتیک جمعیت ذخایر شگ­ماهیان این دریا صورت نگرفته و اطلاعات اکولوژیکی در مورد آن­ها محدود است. با توجه به این­که شگ­ماهیان بخاطر رژیم غذایی پلانکتون­خواری در سطوح اولیه هرم اکولوژیکی و زنجیره غذایی قرار می­گیرند، لذا حفظ این ماهیان در سلامت اکوسیستم دریای خزر مطمئنا” می ­تواند اثرات قابل توجهی داشته باشد. از این­رو با توجه به موارد ذکر شده، این ضرورت احساس شد تا از وضعیت ساختار جمعیتی گونه A. braschnikowi به­عنوان یکی از گونه­ های بومی راسته شگ­ماهی شکلان در دریای خزر اطلاعاتی در دسترس قرار گیرد. بی شک این تحقیق زمینه­ ساز مطالعات متعدد دیگری بر روی دیگر گونه­ ها و جنس­های شگ­ماهیان دریای خزر خواهد شد.

۱۹-۱- اهداف

با توجه به موارد ذکر شده تحقیق حاضر با هدف پاسخ به سؤالات زیر صورت پذیرفت:
۱- آیا نشانگرهای ریزماهواره مورد استفاده در این پژوهش از توانایی و کاربرد لازم جهت شناسایی آلل­ها و نشان دادن میزان تنوع ژنتیکی شگ­ماهی براشنیکووی برخوردارند؟
۲- تنوع ژنتیکی شگ­ماهی خزری در سواحل جنوبی دریای خزر چگونه است؟ آیا مناطق مورد بررسی از نظر ژنتیکی از یکدیگر متمایز هستند یا هم­پوشانی از خود نشان می­ دهند؟ آیا شباهت­ها یا فاصله­های ژنتیکی متأثر از فواصل جغرافیایی بین مناطق نمونه­برداری می­باشند؟

۲۰-۱- فرضیه ­ها

۱- نشانگرهای مورد استفاده در تحقیق حاضر کارایی لازم را برای جداسازی و تشخیص جمعیت­های احتمالی از شگ­ماهی براشنیکووی در دریای خزر دارند.
۲- شگ­ماهی براشنیکووی (A. braschnikowi) در دریای خزر از تنوع آللی و ژنتیکی مناسبی برخوردار است ولی بین مناطق مورد بررسی تمایز اندکی وجود دارد.
فصل دوم
پیشینه تحقیق
۱-۲- مروری بر مطالعات انجام شده در داخل کشور
خـارا (۱۳۸۳) با استفـاده از روش PCR-RFLP روی قطعـه‌ای از ژنـوم میتوکنـدریایی به طـول bp3500 شـامـل tRNA-glu، tRNA-lu، N/D 5/6 و Cyt b توانست ماهی سیم دریای خزر (Abramis brama) را از ماهی سیم دریاچه سد ارس جدا کند. نتایج نشان دادند که ماهی سیم دریای خزر دارای تنوع بیشتری نسبت به ماهی سیم سد ارس می‌باشد.
بر اساس مطالعات صورت گرفته ساختار ژنتیکی ماهی شیپ Acipenser nudiventris سواحل جنوبی دریای خزر و رودخانه اورال با بهره گرفتن از روش میکروستلایت مورد بررسی قرار گرفت (صفری و همکاران، ۱۳۸۶). در این بررسی ۱۰۴ نمونه ماهی شیپ از دو منطقه نمونه برداری شمال (ناحیه رودخانه اورال) و جنوب (نواحی انزلی ، کیاشهر، سفیدرود، نوشهر، بابلسر و گرگان) دریای خزر از سال ۱۳۸۱ تا ۱۳۸۴ جمع آوری شدند. چهار جفت پرایمر مورد استفاده پنج جایگاه ژنی تولید کردند که سه جفت از آن­ها پلی مورف بود. میزان متوسط هتروزیگوسیتی مورد انتظار (۸۶/۰) و میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده (۶۸۵/۰) بود. آنالیز تنوع ژنتیکی بیشترین اختلاف را بین نمونه های هر ناحیه ۶۴%، اختلاف بین مناطق نمونه برداری ۳۲% و اختلاف بین نواحی نمونه‌برداری ۴% نشان داد. بیشترین شباهت بین نمونه‌های اورال و نوشهر و کمترین شباهت بین نمونه‌های سفیدرود و کیاشهر مشاهده شد. بر طبق نتایج به دست آمده جمعیت ماهی شیپ سواحل جنوبی دریای خزر از اورال جدا می­باشد و به نظر می‌رسد بیش از یک جمعیت در حوضه جنوبی دریای خزر وجود دارد.
در بررسی صورت گرفته توسط کیوان شکوه تنوع ژنتیکی در ماهی کلمه (Rutilus rutilus caspius) نمونه برداری شده از مناطق تالاب انزلی و خلیج گرگان با بهره گرفتن از روش RAPD مورد ارزیابی قرار گرفت. در مجموع ۹۴ باند در هر دو منطقه دیده شد و هر دو جمعیت درصد مشابهی از پلی مورفیسم را نشان دادند و میزان فاصله ژنتیکی Nei نیز بین نمونه‌ها کم بود (D = 0.04) که علت آنرا ناشی از برنامه‌های باسازی ذخایر صورت گرفته در این گونه دانستند (کیوان شکوه، ۲۰۰۶).
در مطالعه­ ای ساختار جمعیتی ماهی سیاه کولی (Vimba vimba persa) با بهره گرفتن از نشانگرهای ریزماهواره بین دو رودخانه حویق و گرگانرود بررسی شد. میانگین تعداد آلل در هر جایگاه ۷۵/۶ و میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب ۸۱۷/۰ و ۷۳۵/۰ به­دست آمد و براساس مقادیر محاسبه F_st اعلام کردند که دو جمعیت معنی­دار از ماهی سیاه­کولی در سواحل شرقی و غربی دریای خزر وجود دارد. میزان F_st به میزان ۰٫۰۶۱ و جریان ژنی N_m نیز ۳٫۶۰۱ محاسبه گردید (محمدیان و همکاران، ۱۳۸۹).
مقایسه ژنتیکی ماهی سفید دریای خزر (Rutilus frisii kutum) با بهره گرفتن از ۱۰ جفت نشانگر ریزماهواره بین رودخانه­های گرگانرود و چشمه کیله وجود تنگنای ژنتیکی را برای این گونه نشان داد (رضایی و همکاران، ۱۳۸۹). میانگین تعداد آلل­ها در سطح جمعیت­ها ۹۵/۷ بود که پایین­تر از مقدار مشاهده شده برای ماهیان رودکوچ است. مقدار هتروزیگوسیتی مشاهده شده در گرگانرود ۸۰/۰ و در چشمه کیله ۷۴/۰ به­دست آمد. میزان فاصله ژنتیکی بین مناطق را بسیار کم و ۰۳/۰ اعلام کردند.
قلیچ­پور و همکاران (۱۳۸۹) به مقایسه ساختار ژنتیکی دو جمعیت کپور معولی (Cyprinus carpio) در مناطق قره­سو و انزلی با بهره گرفتن از هشت نشانگر ریزماهواره با به­کار بردن ۵۶ نمونه پرداختند و اعلام کردند که جمعیت­های مورد بررسی از تنوع ژنتیکی و غنای آللی قابل قبولی برخوردارند. تمایز ژنتیکی اندک بین دو منطقه (۰٫۰۱۷) نیز به­دست آمد که علت آن را مهاجرت طبیعی ماهیان عنوان کردند.
کشیری و همکارن (۱۳۸۹) به بررسی چندشکلی ریزماهواره­ای در جمعیت­های طبیعی گونه در معرض تهدید ماهی کلمه (Rutilus rutilus caspius) در سواحل استان گلستان پرداختند و از ۱۰ جایگاه ژنی استفاده کردند. میزان آلل متوسط ۳/۱۰ و متوسط هتروزیگوسیتی ۶۷/۰ را برای این مطالعه بیان داشتند و دلیل انحراف بالا از تعادل هاردی- واینبرگ را ناشی از کسری هتروزیگوسیتی مشاهده شده دانستند واحیای محل­های تخم­ریزی این گونه را در حفظ تنوع ژنتیکی مناسب این گونه مؤثر بیان کردند.
بررسی تنوع ژنتیکی ماهی کفال طلایی (Liza aurata Risso, 1810) با بهره گرفتن از نشانگرهای ریزماهواره در سواحل استان گلستان نیز از دیگر تحقیقات صورت گرفته در این زمینه است. در این مطالعه نشان داده­شد که تمایز بارز ژنتیکی بین دو منطقه گمیشان و میان­کاله وجود نداشته است و میزان نسبتا بالایی از جریان ژنی وجود داشته است (قدسی و همکاران، ۱۳۹۰). همچنین محافظت و بازسازی زیستگاه­ها را در افزایش اندازه جمعیت و کاهش خطر آسیب­پذیری این گونه در آینده مؤثر دانستند.

۲-۲- مروری بر مطالعات انجام شده در خارج از کشور

یو و همکاران (۲۰۰۱) به بررسی تنوع ژنتیکی میگوی ببری مشکی (Penaeus monodon) در چهار منطقه جغرافیایی و دو منطقه پرورشی و ارتباط آن با تراکم پرورش و مانگروها در فیلیپین پرداختند. تمامی نشانگرهای مورد استفاده چند شکلی نشان دادند و ۱۸۴ آلل مختلف در مجموع لوکوس­ها مشاهده کردند و رنج آللی را از ۶ تا ۵۴ آلل در لوکوس­ها بیان کردند. رنج هتروزیگوسیتی را از ۴۷/۰ تا ۰۰/۱ و تعداد ژنوتیپ­ها را از ۵ تا ۷۰ در هر لوکوس گزارش نمودند. شاخص Fst نیز تمایز ژنتیکی معنی­داری را بین چهار جمعیت وحشی نشان داد و همچنین تمایز ژنتیکی بین چهار منطقه میگوی وحشی همبستگی مثبتی را با وضعیت مانگروها و تراکم پرورش نشان داد.
بارتفئی در سال ۲۰۰۳ بررسی بر روی ساختار ژنتیکی دو استوک کپور پرورشی (Cyprinus carpio) با بهره گرفتن از ۴ مارکر میکروستلایتی و ۱۰ مارکر RAPD انجام داد. داده‌های حاصل از میکروستلایت جزئیات بیشتری از تنوع ژنتیکی را نشان دادند اما داده‌های حاصل از هر دو مارکر نبود تنوع ژنتیکی بارز بین دو استوک را نشان داد. تعداد میانگین الل در لکوس برای استوک‌ها ۹ و ۵/۹ به دست آمد، مقدار هتروزگوسیتی مورد انتظار ۸۳/۰ و ۸۱/۰ و هتروزگوسیتی مشاهده شده نیز برای هر دو جمعیت ۶۹/۰ به دست آمد (بارتفئی، ۲۰۰۳).
در مطالعه­ ای بر روی دو گونه Alosa alosa و Alosa fallax هشت جفت نشانگر ریزماهواره دی‌نوکلئوتید طراحی و استفاده شدند. تعداد آلل در لوکوس از ۳ تا ۹ عدد برای A. alosa و از ۲ تا ۷ برای A. fallax به­دست آمد. همچنین میزان هتروزیگوسیتی را برای این دو گونه به ترتیب از ۲۶/۰ تا ۹۲/۰ و ۲۴/۰ تا ۷۲/۰ اعلام کردند (فاریا و همکاران، ۲۰۰۴).
بر اساس مطالعه صورت گرفته در سال ۲۰۰۴ بر روی قزل‌آلای رنگبن کمان پرورشی (Oncorhynchus mykiss) از سه منطقه تعداد ۱۵۲ نمونه را با بهره گرفتن از ۹ لکوس میکروستلایتی پلی‌مورف مورد بررسی تنوع ژنتیکی قرار دادند که بر اساس نتایج حاصله تعداد ۱۲۶ الل در کل لکوس‌ها به دست آمد. تعداد ۲۴-۹ و بطور متوسط ۱۴ آلل در هر لکوس مشاهده شد، و مقدار هتروزیگوسیتی مشاهده شده نیز از ۳/۹۶-۱/۴۲ با مقدار متوسط ۵/۷۱ متغیر بود. انحراف از تعادل هاردی-واینبرگ در تمام جمعیت‌ها دیده شد که علت آن را وجود زیر ساختارهایی در جمعیت‌ها دانستند که منجر به اثر Wahlund شده بود (سیلورستین، ۲۰۰۴).
از جمله تحقیقات صورت گرفته در خارج از کشور می­توان به بررسی شش جمعیت از کپور معمولی (Cyprinus carpio) با بهره گرفتن از ۳۰ جفت نشانگر ریزماهواره اشاره کرد. در این مطالعه میانگین تعداد آلل در هر لوکوس ۷ و تعداد آلل مؤثر بین ۰۴/۱ تا ۷۲/۴ بود. همچنین اعلام کردند که بین نتایج حاصل از آنالیز خوشه­ای و فواصل جغرافیایی همبستگی وجود دارد (لی و همکاران، ۲۰۰۷).
در تحقیقی بر روی شگ­ماهی آمریکایی (Alosa sapidissima) از ۱۶ جفت نشانگر ریزماهواره استفاده شد (جولیان و بارترون، ۲۰۰۷). تعداد آلل مشاهده شده در هر لوکوس را از ۸ تا ۳۲ و بطور متوسط ۴/۱۵ آلل در هر لوکوس گزارش کردند. میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده را ۱/۸۱% اعلام کردند.
هشت نشانگر ریزماهواره در تحقیقی بر روی ماهی سیچلاید (Pseudocrenilabrus multicolor victoria) در آگاندا طراحی و استفاده شد و رنج آللی را برای این ماهی ۴ تا ۱۹ آلل و میزان هتروزیگوسیتی را برای آن ۸۵/۰ اعلام کردند و این نشانگرها را برای استفاده در مطالعه ساختار جمعیت­های این ماهی در آگاندا مناسب اعلام کردند (کریسپو و همکاران، ۲۰۰۷).
بر اساس بررسی صورت گرفته بر روی ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان ۱۴ مارکر میکروستلایتی برای بررسی تنوع ژنتیکی این گونه مورد استفاده قرار گرفت که بدین منظور از ۶ جمعیت پرورشی نمونه‌گیری شد، با بررسی نتایج تعدادالل موثر ۸۹/۲-۵۳/۱ با میانگین ۱۲/۲ الل در هر لکوس به دست آمد.بر اساس نتایج حاصل از فاصله ژنتیکی Nei، دو گروه ژنی مختلف شناسایی شد (گراس، ۲۰۰۷).
از ۹ لکوس اختصاصی برای مقایسه تنوع ژنتیکی ماهی Tinca tinca در دو جمعیت وحشی و چهار جمعیت اهلی استفاده شد. تعداد هفت لکوس با رنج اللی ۱۹-۲ پلی مورفیسم نشان دادند، جمعیت­های وحشی درصد بالاتری از تنوع را نشان دادند اما این تفاوت معنی دار نبود، درمجموع تنوع ارزیابی شده بر اساس F_st در مقایسه بین تمام نمونه­ها معنی­دار بود (کوهلمن، ۲۰۰۷).
در تحقیقی که بر روی صدف Haliotis discus انجام شد از هفت نشانگر پلی‌مورف میکروستلایتی برای بررسی جمعیت‌های پرورشی این گونه استفاده شد، بر اساس نتایج حاصله به طور متوسط تعداد ۸۳/۶ الل در هر لکوس مشاهده شد و میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و قابل انتظار نیز به ترتیب ۷۱/۰ و ۷۰/۰ به دست امدند. با مقایسه نتایج حاصل از این تحقیق با بررسی‌های صورت گرفته بر روی گونه‌های مشابه مشخص شد که در این جمعیت‌ها کاهش غنای اللی به میزان ۵۸-۱۱% آلل در هر لکوس رخ داده است. که علت آن­را کم بودن تعداد مولدین که منجر به افزایش انحراف ژنتیکی شده و همچنین افزایش احتمال درون‌آمیزی دانستند.(مرچنت، ۲۰۰۸).
بائی و همکاران (۲۰۰۸) از شش جایگاه ژنی ریزماهواره در بررسی بر روی تنوع ژنتیکی چهار جمعیت‌ پرورشی باس دهان بزرگ (Micropterus salmoides) استفاده کرد و نتایج حاصل از آن­را با نمونه‌های وحشی مقایسه کرد، تعداد آلل در هر جایگاه در هر چهار جمعیت مشابه و میانگین آن ۱۷/۲ به­دست آمد که کمتر از مقدار آن در جمعیت‌های وحشی ۵۵/۵ بود. همچنین میانگین مقدار هتروزگوسیتی مشاهده شده در جمعیت‌های پرورشی (۳۷/۰) در مقابل ۵۱/۰ جمعیت‌های وحشی بود. با توجه به کاهش شدید تنوع آللی و کاهش هتروزیگوسیتی که همراه با علائمی از کاهش N_e نیز بود به این نتیجه رسیدند که تنگنای ژنتیکی رخ داده است.
در تحقیق که بر روی میگوی چینی (Fenneropenaeus chinensis) انجام شد از هفت نشانگر ریزماهواره برای بررسی ساختار ژنتیکی آن در هفت منطقه استفاده شد و در مجموع ۱۰۹ آلل در کل جایگاه­ها به­دست آمد. نتایج حاصل از انالیز AMOVA و فاصله ژنتیکی سه منطقه با جمعیت‌های مجزا را نشان داد (منگ، ۲۰۰۹).
بر اساس مطالعات صورت گرفته در سال ۲۰۰۹ بر روی صدف آب شیرین Hyriopsis cumingii از هشت نشانگر ریزماهواره برای بررسی ساختار ژنتیکی در دو منطقه پرورشی و چهار منطقه وحشی استفاده شد که در مجموع ۹۶ الل در شش منطقه دیده شد، نتایج تنوع ژنتیکی بالاتری را در جمعیت‌های وحشی در مقایسه با جمعیت‌های پرورشی نشان دادند در حالیکه جمعیت‌های پرورشی میزان بالاتری از درون‌آمیزی (f=0.10-0.11) را در مقایسه با جمعیت‌های وحشی (f=0.02-0.10) نشان دادند. AMOVA نشان داد که تنوع درون جمعیت‌ها ۹۵/۸۲ % و تنوع بین جمعیت‌ها ۱۸/۴% می‌باشد. (لی و همکاران، ۲۰۰۹).
نتایج حاصل از آنالیز نشانگرهای دی ان ای ریزماهواره تمایز ژنتیکی بین جمعیت­های وحشی و پرورشی گوازیم­ماهی (Polydactylus sexfilis) در هاوایی نشان نداد (پان و یانگ، ۲۰۱۰). در این مطالعه از ۱۵ نشانگر ریزماهواره استفاده کردند که در این بین شش نشانگر که چندشکلی بالایی نشان داده بودند برای آنالیزهای بعدی استفاده شدند. در مجموع ۳۷ آلل در سطح شش جایگاه در دو جمعیت شناسایی شد. شاخص Fst در این مطالعه ۰۰۱/۰ و مقدار هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب ۶۶/۰ و ۷۵/۰ به­دست آمد. نتایج حاصل از آنالیز تنگنای ژنتیکی نشان داد که جمعیت هچری با تعداد کافی مولد یافت شده به­ طوری که ضریب درون­آمیزی بسیار پایینن (۰۷/۰-۰۵/۰) در هر دو جمعیت مشاهده شد.
ساختار جمعیتی ماهی مرمری صخره­ای (Sebastiscus marmoratus) در چهار منطقه جغرافیایی با بهره گرفتن از ۱۱ جفت نشانگرهای ریزماهواره توسط سان و همکاران (۲۰۱۱) بررسی گردید. ۸۲ آلل مختلف در این مطالعه شناسایی و بازه وزنی آن از bp101 تا bp255 گزارش شد و میانگین تعداد آلل مؤثر را ۴۳/۴ بود. همچنین میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده را ۶۴/۰ و هتروزیگوسیتی مورد انتظار را ۶۵/۰ اعلام کردند. شاخص جدایی جمعیت­ها بطور میانگین ۱۵/۰ و انحراف بالا از تعادل هاردی-واینبرگ را به دلیل هتروزیگوسیتی بالا بیان کردند.
راجاسکار و همکاران (۲۰۱۲) به بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت­های وحشی (دو جمعیت) و پرورشی (یک جمعیت) سوف آسیایی غول­پیکر (Lates calcarifer) با بهره گرفتن از ۱۰ نشانگر رپید (RAPD) پرداختند. در این مطالعه ۵۸۹ باند مشاهده شد که ۱۲/۹۳% آن­ها چندشکلی نشان دادند. میزان تنوع ژنتیکی در جمعیت­های وحشی بیش­تر از پرورشی اعلام گردید و الگوی دندروگرام با بهره گرفتن از روش UPGMA نیز دو جمعیت وحشی را بر روی یک کلاد و جمعیت پرورشی را بروی کلاد جداگانه­ ای دیگر قرار داد.
فصل سوم
مواد و روش‌ها
۳- مواد و روش‌ها

۱-۳- نمونه‌برداری

تعداد ۱۴۰ نمونه شگ­ماهی براشنیکووی از سواحل مناطق انزلی (E: 49°۲۶’, N: 37°۲۵’)، گمیشان (E: 54°۰۴’, N: 37°۰۴’)، محمودآباد (E: 52°۱۵’, N: 36°۳۷’)، میان­کاله (E: 53°۳۵’, N: 36°۴۸’)، ساری (E: 53°۰۳’, N: 36°۳۳’) (هرمنطقه ۲۸ نمونه) در پاییز تا دی ماه سال ۱۳۹۲با استفاده از صید پره نمونه­برداری و از هر ماهی باله دمی جهت استخراج DNA قطع و داخل تیوپ­های حاوی الکل ۹۶% فیکس شدند. سپس تمامی نمونه­ها به آزمایشگاه ژنتیک و بیوتکنولوژی آبزیان دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان جهت انجام آزمایشات منتقل شدند.
شکل ۱-۳- نقشه مناطق نمونه برداری ماهی A. braschnikowi در سواحل جنوبی دریای خزر در مطالعه حاضر

۲-۳- استخراج DNA

در فرایند استخراج DNA به روش فنول- کلروفرم از محلول­ها و بافرهایی استفاده می­ شود که نحوه آماده سازی آن­ها در زیر آمده است: