وبلاگ

نگرانیهایت را در به ثمر رسیدنم سپاس می گویم .

تقدیم به همسرم ، او که بودنم را با لطفش، کوتاهیم را با بزرگواریش ، ناملایماتم را با صبرش و بدیهایم را با گذتش بخشید او که زندگی ام را امید بخشید .

با سپاس و قدردانی فراوان از استاد گرانقدر جناب آقای دکتر مجید غلامی ، بزرگواری که بی هیچ دریغی لحظات ارزشمندشان را در اختیار بنده گذاشتند و با راهنمایی های خود باعث به سرانجام رسیدن این موفقیت شدند .

با تشکر از استاد ارجمند جناب آقای دکتر عزت الله فتحی که افتخار شاگردی در محضرشان را داشتم و در بحث مشاوره این پایان نامه بر عهده ایشان بود .

سپاس از استاد بزرگوار جناب آقای دکتر نامجو که علاوه بر افتخار شاگردی زحمت داوری و راهنمایی هایی در مباحث مختلف پایان نامه بر عهده ایشان بود.

و با سپاس از همه آنهایی که به من آموختند و تعالی مرا انتظار کشیدند .

فهرست مطالب

عنوان صفحه

چکیده ۱

۱-۱- مقدمه ۳

۱-۲- بیان مسئله ۴

۱-۳- مروری بر سابقه تحقیق ۴

۱-۴- اهداف، فرضیات و سوالات تحقیق ۶

۱-۴-۱- اهداف تحقیق ۶

۱-۴-۱-۱- هدف کلی ۶

۱-۴-۱-۲- اهداف جزئی ۶

۱-۴-۲- فرضیات تحقیق ۶

۱-۴-۳- سئوالات تحقیق ۶

۱-۵- روش تحقیق و پژوهش ۷

انگل‌ها و بیماری‌های طیور و سایر پرندگان ۹

۲-۱- انگلهای خارجی ۹

۲-۱-۱- ساسها ۹

۲-۱-۲- شپشهای گزنده ۹

۲-۱-۳- مگسهای سیاه ۱۰

۲-۱-۴- مایت‌های ماکیان ۱۰

۲-۱-۵- لارومایت ها ۱۰

۲-۱-۶- سوسک بستر و لارو آن آلفیتوبیوس دپاپرینوس ۱۱

۲-۱-۷- مایت‌های پر و مایت‌های ایجادکننده پرریزی ۱۱

۲-۱-۸- مایت‌های زیر پوستی ۱۱

۲-۲- انگل‌های داخلی ۱۲

۲-۲-۱- کیسه ملتحمه ۱۲

۲-۲-۲- نای ۱۳

۲-۲-۴- پیش معده ۱۴

۲-۲-۵- سنگدان ۱۴

۲-۲-۶- روده باریک ۱۵

۲-۲-۷- روده کور ۱۶

۲-۲-۸- پوست ۱۷

۲-۳- بیماری‌های انگلی طیور ۱۷

۲-۳-۱- کوکسیدیوز ۱۷

۲-۳-۲- کریپتوسپوریدیوز ۲۰

۲-۳-۳- هگزامیتیازیس ۲۴

۲-۳-۴- هیستومونیازیس ۲۷

۲-۳-۵- لکوسیتوزئونوز ۳۲

۲-۴- واکنش زنجیر‌های پلی مراز( PCR ) 35

۲-۴-۱- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR 36

۲-۴-۲- سنتز ۳۶

۲-۴-۳- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR: 37

۳-۱- نمونه گیری ۴۰

۳-۲- استخراج DNA از کبد با بهره گرفتن از کیت ۴۰

۳-۳- استخراج DNA از خون با بهره گرفتن از کیت ۴۱

۳-۴- آزمایش PCR 42

۳-۴-۱- روش کار ۴۲

۳-۵- تهیه ژل آگارز ۴۳

۳-۵-۱- مواد و وسایل لازم ۴۳

۳-۵-۲- روش تهیه بافر (۱X) TBEبرای تهیه ژل آگارز ۴۴

۳-۵-۳- روش تهیه ژل آگارز ۴۴

۳-۵-۴- روش انجام الکتروفورز ۴۴

۳-۵-۵- آنالیز محصول PCR: 45

۳-۶- آزمایشات هیستوپاتولوژی ۴۵

۳-۶-۱- رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) : 45

۳-۶-۲- روش رنگ آمیزی اسلاید با رنگ (H&E) : 46

۳-۶-۳- تفسیر رنگ آمیزی (H&E) 47

۳-۶-۴- نتایج رنگ آمیزی (H&E) 48

۴-۱- نتایج کیفی مربوط به استخراج DNA 50

۴-۲- نتایج آزمایشات هیستوپاتولوژی ۵۱

۵-۱- بحث ۵۳

۵-۲- پیشنهادات ۵۶

منابع ۵۷

فهرست شکل‌ها

عنوان صفحه

شکل ۴-۱- الکتروفورز محصولات PCR به منظور تکثیر ژن انگل هیستومونیازیس در نمونه‌های خون و کبد بوقلمون بر روی ژل آگارز ۱%. ۵۰

شکل ۴-۲- مشاهده مقاطع انگل هیستوموناد در بین هپاتوسیت‌های کبدی. ۵۱

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول ۴-۱- مقایسه روش ردیابی از طریق PCR و آزمایشات هیستوپاتولوژی ۵۱

چکیده

به منظور ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون‌های کشتار شده در استان اصفهان، ۲۰۰ نمونه خون و ۲۰۰ نمونه کبد در کشتارگاه اخذ شد و پس از استخراج DNA، قطعه ۵۵۰ جفت بازی مربوط به ژن ۱۸SRNA تکثیر شد. علاوه بر آن، نمونه‌های کبد در فرمالین ۱۰% نگهداری و پس از تهیه مقاطع پاتولوژی رنگ آمیزی با هماتوکسیلین - ائوزین از نظر وجود انگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج PCR نشان داد از ۲۰۰ نمونه خون، ۱۸ نمونه (۹%) و از تعداد ۲۰۰ نمونه کبد، ۳۲ نمونه (۱۶%) از لحاظ هیستوموناس مله اگریدیس مثبت می‌باشد. نتایج هیستوپاتولوژی نشان داد از بین نمونه‌های PCR مثبت ۷۶/۱۱ % در هیستوپاتولوژی مثبت ارزیابی شدند لذا به نظر می‌رسد برای شناسایی هیستوموناس مله اگریدیس PCR از ویژگی بالایی برخوردار می‌باشد.

کلید واژه‌ها : بوقلمون، هیستوموناس مله اگریدیس، PCR، اصفهان.

فصل اول

«مقدمه و طرح تحقیق»

۱-۱- مقدمه

در دهه‌ های اخیر به دلیل رشد جوامع بشری، نیاز به منابع غذایی به خصوص اقلام پروتئینی حیوانی افزایش یافته است وپرورش بوقلمون به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیاز در سراسر جهان درحال گسترش می‌باشد.درسال۲۰۰۴ ایالات متحده باتولید ۲۵۹۲۰۰۰ تن گوشت بوقلمون در رتبه نخست بوده است.درکشور ما نیز پرورش بوقلمون صنعتی در سال‌های اخیر رشد قابل توجهی داشته به طوری که تولید گوشت آن به صور مختلف قطعه بندی شده ویا لاشه قابل عرضه می‌باشد (۵).

در ایران صنعت پرورش بوقلمون از سال۱۳۵۵ آغاز گردیده وهرساله به تعداد مزارع بوقلمون درکشور اضافه می‌شود (۱).

باتوجه به خصوصیات پرورشی مناسب بوقلمون‌های گوشتی، نظیر میزان وزن گیری، سرعت رشد زیاد (۷۴/۱۰ کیلوگرم در۱۶ هفتگی برای بوقلمون‌های ماده و ۳۹/۲۰ کیلوگرم در۲۰ هفتگی برای بوقلمون‌های نر) ضریب تبدیل غذایی پایین،درصد اندک افت لاشه وارزش غذایی مناسب در مقایسه سایر طیور صنعتی،پرورش این پرنده به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیازها در سراسر جهان درحال گسترش است به طوری که در سال ۲۰۰۷ ایالات متحده، اتحادیه اروپا، برزیل و کانادا ازنظر تولید گوشت بوقلمون درسطح جهان به ترتیب دررتبه‌های اول تا چهارم قرار داشتند (۷).

۱-۲- بیان مسئله

هیستومونیازیس ^[۱] بیماری تک یاخته‌ای حاد است. هیستوموناس مله اگریدیس^[۲] تک تاژک است. تک‌یاخته‌های انگلی باعث هپاتیت سکوم می‌شوند.سایت‌های هجومی این انگل سکوم و کبد می‌باشد واختلال گردش خون درمراحل بعدی این بیماری به نظر می‌رسد وباعث یک بیماری سرسیاه در پرنده می‌شود.

در دهه‌ های اخیر هیستومونیازیس موجب شده است تا آسیب جدی به صنعت طیور، به ویژه در میان بوقلمون وارد شود. موارد کمی از بروز بیماری در ماکیان نیز گزارش شده است ولی ماکیان به علت مقاومت در مقابل بیماری، بیشتر نقش مخزن بیماری را داشته و در صورت آلودگی به کرم هتراکیس گالیناروم^[۳]، نقش مهمی در انتقال بیماری به بوقلمونها بازی می‌نمایند. جوجه بوقلمونها با خوردن تخمهای آلوده هتراکیس به بیماری مبتلا می‌شوند. این بیماری انتشار جغرافیایی وسیعی در دنیا دارد. مشاهدات درمانگاهی وکالبدگشایی در ایران نشان دهنده‌ی حضور بیماری می‌باشد (۲۹).

۱-۳- مروری بر سابقه تحقیق

در مطالعه‌ای که توسط Cortes و همکاران (۲۰۰۴) در گله جوجه‌های تجاری با ۶ هفته سن صورت گرفت نشان داد علائم کلینیکی شامل افسردگی و با آب و تاب راه رفتن، بی علاقگی وافزایش اندکی در مرگ و میر دارند. این اولین گزارش از حضور هیستومونیازیس در بورس فابرسیوس در جوجه‌های تجاری است (۱۰).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Hurst (1980) با موضوع بررسی هیستومونیازیس در بوقلمون‌های وحشی در می‌سی سی پی آمریکا صورت گرفت، نشان داد در جمعیت بوقلمون‌های وحشی با تراکم بالا، انگل هیستومونیازیس وجود دارد (۱۹).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Lotfi و همکاران (۲۰۱۲) انجام شد نشان داد انگل هیستومونیازیس در خارج از بدن میزبان به طور خیلی ضعیف زنده می‌ماند. این بررسی در شرایط مشابه مزرعه و در دمای اتاق بر روی چند ماده مصنوعی انجام گرفت که نتایج آن شامل: تک یاخته تا یک ساعت بر روی چوب، لاستیک وفلز، تا ۳ساعت در جعبه‌های تخم مرغ، پوسته‌های تخم مرغ وآجر، تا ۶ساعت در پر و بال و خوراک بوقلمون و تا ۹ ساعت در آب لوله کشی کلر نزده و مدفوع زنده می‌ماند. بنابراین آب آلوده و مدفوع تازه و یا هر دو می‌توانند نقش مهمی در انتقال انگل بازی کنند (۲۴).

در مطالعه‌ای که توسط McDougald (2005) با موضوع هیستومونیازیس در پرندگان در رودایسلند انجام شد نشان داد که بیماری سر سیاه باعث مرگ و میر بالا در بوقلمون‌ها گاهی نزدیک به ۱۰۰ درصد ودر جوجه‌ها میزان مرگ و میر ممکن است با عوارض بالا از ۲۰ تا ۱۰۰ درصد همراه باشد. دراین تحقیق نشان داده شد هیستومونیازیس به سرعت در گله‌ی بوقلمون از طریق تماس مستقیم پرندگان با یکدیگر پخش می‌شود و احتمالأ مربوط به پدیده کلوآک نوشی است. در این تحقیق بر وابستگی به هتراکیس گالیناروم به عنوان منبع عفونت ذکر شده است (۲۹).

در مطالعه دیگر که توسط Patra و همکاران (۲۰۱۳) در هند با هدف شناسایی میزان بروز هیستومونیازیس در پرندگان گوشتی از طریق مولکولی انجام شد نشان داد از ۴۰۰۰ پرنده مورد بررسی قرار گرفته ۴۰ پرنده به هیستومونیازیس مله آگریدیس مبتلا بودند یا به عبارتی میزان شیوع ۱ درصد بود (۳۲).

در گزارشی که توسط Popp و همکاران (۲۰۱۱) انجام شد نشان داد که مزرعه‌ای ارگانیک در جنوب آلمان به مدت ۳ سال متوالی در میان جوجه‌های گوشتی و بوقلمون‌ها، شیوع یک بیماری شدید ناشی از انگل تک یاخته هیستومونیازیس مله اگریدیس رخ داده است و تشخیص از طریق DNA بوده است (۳۳).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Senties-Cue و همکاران (۲۰۰۹) انجام شد نشان داد در بوقلمون‌هایی با سن ۷ تا ۱۳ هفتگی علایمی همچون بی اشتهایی، افسردگی، اسهال، از دست دادن وزن و افزایش مرگ و میر داشتند. علائم کالبدگشایی آن شامل ضخیم شدن شدید دیواره سکوم، بزرگ شدگی بورس، پانکراس و طحال کم رنگ و زرد بود. میکروسکوپ الکترونی حضور هیستومونیازیس در کبد و سکوم را تایید کرد. این اولین گزارش حضور سیستمیک هیستومونیازیس موثر بر بورس فابرسیوس، کلیه‌ها، ریه، پانکراس و پیش معده در بوقلمون است (۳۸).

۱-۴- اهداف، فرضیات و سوالات تحقیق

۱-۴-۱- اهداف تحقیق

۱-۴-۱-۱- هدف کلی

ردیابی انگل هیستوموناس مله آگریدیس در گله‌های بوقلمون استان اصفهان به روش PCR

۱-۴-۱-۲- اهداف جزئی

برآورد میزان فراوانی

۱-۴-۲- فرضیات تحقیق

هیستومونیازیس دربوقلمون‌های اصفهان وجوددارد.

۱-۴-۳- سئوالات تحقیق

آیا هیستومونیازیس در بوقلمون‌های اصفهان وجود دارد؟

۱-۵- روش تحقیق و پژوهش

الف : نمونه گیری :

به منظوربررسی آلودگی Histomoniasis Meleagridisدرگله‌های بوقلمون استان اصفهان، بامراجعه به کشتارگاه بوقلمون واقع دراستان اصفهان شامل شهرستانهای تیران و کرون و نجف آباد ۲۰۰ نمونه خون و ۲۰۰ نمونه کبد از ۲۰ گله بوقلمون اخذ ونمونه‌ها درکنار یخ به آزمایشگاه منتقل گردید وتا زمان انجام آزمایشات دردمای۲۰- درجه سانتی گراد نگه داری شد.

ب : استخراج DNA

نمونه خون وکبد پس از هموژن سازی با بهره گرفتن از کیت تخلیص DNA (Korea،(Bioneer استخراج می‌گردد.

پرایمرهای مورد استفاده (Hmf،Hmr) براساس توالی منتشرشده توسط Liu و همکاران در سال ۲۰۱۱ سنتزگردید (۲۲).

مخلوط واکنش با حجم نهایی ۲۵میکرولیتر شامل ۴ میلی مول کلرید منیزیم، ۵ میکرومول از پرایمر، ۵/۲ میکرولیتر از بافر Taq10x، ۲/۰ میکرومول از هر کدام dNTP‌ها،۱/۲۵ واحد از Taq DNA Polymerase و ۲ میکرولیتر از نمونه DNA می‌باشد. دمای واکنش شامل واسرشت سازی اولیه ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه، همراه با ۳۸ سیکل ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ ثانیه (واسرشت سازی) ۵۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱دقیقه (همسرشت‌سازی) و ۷۲درجه سانتی‌گراد به مدت ۱ دقیقه (گسترش) همراه با ۷۲ درجه سانتی گرادبه مدت ۱۰ دقیقه گسترش نهایی می‌باشد. محصول PCR برروی ژل ۵/۱ درصد الکتروفورز شده و میزان آلودگی به مواد Histomoniasis Meleagridis مشخص شد.

فصل دوم

« کلیات »

انگل‌ها و بیماری‌های طیور و سایر پرندگان

۲-۱- انگلهای خارجی

۲-۱-۱- ساسها

ساس‌های بستر حشرات مکنده خون هستند که بوی خیلی نامطبوعی دارند و این بو هنگامی که خرد می‌شوند به مشام می‌رسد.ساس‌های بستر را می‌توان به وسیله سایر پرندگان به سالن‌های مرغداری برد(۲).

ساسها، پستانداران و پرندگان از جمله طیور را مورد حمله قرار می‌دهند. انگل بالغ تا ۵ میلی مترطول داشته،شکم آن هشت قطعه‌ای است. ساسها در سالنهای خالی می‌توانند برای مدت یک سال زنده بمانند. پرندگان آلوده به ساس خیلی زود لاغر و کم خون می‌شوند(۸).

۲-۱-۲- شپشهای گزنده

شپش دارای چندین جنس و گونه است وممکن است پرندگان به طور همزمان با بیش از یک گونه ازآنها آلوده شوند. اندازه شپشهای طیور بین ۱تا ۶ میلی متر متغیر است ولی ممکن است شپشهای پرندگان وحشی بزرگتر باشند شپش رامعمولأ می‌توان با معاینه دقیق میزبان درناحیه مخرج، نواحی زیر بالها، سر و پاها پیدا کرد.اغلب تخم شپشها را که به پرها چسبیده اند می‌توان دید. تمام سیر تکاملی شپش روی میزبان صورت می‌گیرد ودرصورت جدا بودن از میزبان، فقط ۴ساعت می‌توانند زنده بمانند و سپس ازبین خواهند رفت.احتمالأ شپشها برای اغلب پرندگان رشد یافته، به طورجدی بیماری‌زا نیستند، ولی پرندگان جوانی که دارای آلودگی شدید باشند دچارلاغری شده،ممکن است تلف شوند (۸ و ۵).

۲-۱-۳- مگسهای سیاه

اینها حشراتی به رنگ خاکستری، بزرگ، باپشت خمیده وبه طول ۵ میلی متر هستند. انبوهی از مگسها به پستانداران وپرندگان از جمله طیور حمله می‌کنند. مگس سیاه، تک یاخته عامل بیماری لکوسیتوزئونوزیز و همچنین نوعی فیلاریا به نام ارنیتو فیلاریافالی سن سیس را به اردک انتقال می‌دهد. مگسهای سیاه خونخوار می‌توانند کم خونی شدید ایجاد نمایند و ممکن است پرندگان جوان را بکشند (۸).

۲-۱-۴- مایت‌های ماکیان

طول مایت‌های قرمز معمولأ از۷ /۰ میلی متر بوده، ممکن است خاکستری تا قرمز باشند. این انگل‌های خونخوار ازماکیان وانواع دیگر طیور وپرندگان وحشی تغذیه می‌نمایند، که درنتیجه موجب کم خونی ومرگ پرنده‌ها، بویژه پرندگان جوان می‌شوند. مایت‌های قرمز اکثرأ در شب تغذیه می‌کنند و ممکن است در تمام طول روز روی بدن میزبان پیدا نشوند. آنها را اغلب می‌توان به صورت کلنی‌هایی در شکافها یا درز‌های محل خواب یا آشیانه‌ها دیدکه می‌توانند تا چندین هفته بدون غذا زنده بمانند. گزارش شده است که مایت‌ها، عامل وبای ماکیان و عامل اسپیروکتوز را انتقال می‌دهند. آنها اغلب مرغهای تخمگذار موجود در قفس را آلوده می‌کنند.

۲-۱-۵- لارومایت ها^[۴]

لارومایت نئوسکون گاستیاامریکانا یکی از انگلهای مهم بوقلمون وپرندگان درایالت‌های جنوبی آمریکا می‌باشد. درمورد بوقلمونها لارو انگل به پوست می‌چسبد و موجب جراحات موضعی در پوست می‌شود و کیفیت لاشه را ازنظر بازار مصرف پایین می‌آورد. جراحات آن شبیه جوش بوده ممکن است تعداد آنها خیلی زیاد باشد.

۲-۱-۶- سوسک بستر و لارو آن^[۵] آلفیتوبیوس دپاپرینوس^[۶]

این سوسک ولارو آن که اغلب در بستر سالنهای پرورش طیور وجود دارند، نمی‌توانند به طیور سالم حمله کنند، ولی احتمالأ عامل انتقال بیماری مارک هستند. سم بوتولیسم در این سوسکها پیدا شده، ممکن است درهمه گیریهای بوتولیسم درجوجه‌های گوشتی نقش داشته باشند. اغلب کرمهای پهن توسط سوسکها و سایر حشرات و احتمالأ توسط سوسک بستر انتقال می‌یابند.

۲-۱-۷- مایت‌های پر و مایت‌های ایجادکننده پرریزی^[۷]

مایت‌های مختلفی روی پرها یا شاهپرهای ماکیان، بوقلمون، کبوتر وگنجشک زندگی می‌کنند و حضور و فعالیت این مایت‌ها موجب از دست دادن همه یا بعضی ازپرهای بدن میزبان می‌شود. مایت‌های پر هرکدام به میزبان خاصی تمایل دارند. مایت‌هایی مانند کنمیدوکوپتس گالینه موجب ریزش پرهای میزبان می‌شوند. ازدست دادن پرها به لاغری وشاید به حساس شدن میزبان نسبت به سایر بیماریها منجر می‌گردد.

۲-۱-۸- مایت‌های زیر پوستی^[۸]

این مایت درزیرپوست ماکیان، بوقلمون، کبوتر وغاز ندولهای زرد رنگ ۱تا ۵ میلی متری ایجاد می‌کنند. بیماری‌زایی این مایت‌ها شدید نیست و جراحات ایجادشده ممکن است موجب ضبط لاشه طیور درکشتارگاه شود.

۲-۲- انگل‌های داخلی

انگل‌های داخلی شامل تک یاخته‌ها و کرم‌های انگلی هستند.

کرم‌ها متداول‌ترین انگل‌های داخلی طیورند و سبب کندی رشد، ضعف، لاغری، کاهش تولید تخم مرغ (در دوره تخم گذاری) و مرگ و میر در ماکیان (در هر سنی) می‌شوند.

منابع اصلی آلودگی :

۱- تخم کرم

۲- بستر و خاک آلوده

۳- تماس با مدفوع پرندگان آلوده

۴- دان و آب آلوده

۵- خوردن میزبان‌های واسط مانند مگس، سوسک، حلزون و غیره

۶- انتقال آلودگی از یک سالن به سالن دیگر از راه کفش آلوده و نیز به دلیل بی توجهی در استفاده از تجهیزات آلوده (۶).

۲-۲-۱- کیسه ملتحمه

کرم‌های چشم (Oxyspirura spp =گونه‌های اکسیسپیرورا )

طول این انگلهاتا۲سانتی متر می‌رسد ودر کیسه ملتحمه، اغلب زیرپلک سوم زندگی می‌کنند و موجب تورم بافت ملتحمه، آماس چشم، بیرون زدن پلک سوم وگاهی چسبندگی پلکها می‌شوند. این کرمها، ماکیان، بوقلمون، کبوتر، برخی از پرندگان تفریحی و بسیاری از پرندگان وحشی منبع عفونت برای طیور می‌باشند. گاهی پرنده‌ای که جراحات شدیدی دارد درهنگام معاینه عاری از انگل می‌باشد. سوسکها، برای برخی از گونه‌های کرم‌های چشم، میزبان واسطه هستند (۸).

به نظر می‌رسدپرندگان بومی و وحشی از اهمیت کمی در انتشار این انگل برخوردار باشند (۳۷).

۲-۲-۲- نای

سینگاموس تراکیا^[۹]

این کرم‌ها، نماتود‌های قرمز رنگی هستند که در نای و گاهی در برونش‌های بزرگ زندگی می‌کنند. این انگلها از خون میزبان تغذیه می‌نمایند ودر محل اتصال به نای موجب تورم نای به صورت پراکنده یا کانونی می‌شوند. طول کرمها تا ۲ سانتی متر می‌رسد. هرجفت از این کرمها شامل ۲ جنس نر و ماده اند که حالت چنگال مانند دارند ودائمأ درحال جفت گیری می‌باشند.

ممکن است ماکیان، بوقلمون، قرقاول، طاووس، مرغ شاخدار، جوجه غاز، بلدرچین و بسیاری از پرندگان دیگر به این انگلها مبتلا شوند. نشانه‌های این بیماری شامل : تنفس بادهان باز، تنگی نفس و لرزش سر می‌باشد. پرنده‌هایی که بشدت مبتلا هستند ممکن است خفه شوند. کرمهای خاکی و حلزون‌ها ممکن است به عنوان ناقل یا میزبان‌های کمکی عمل نمایند، ولی سیرتکاملی آن ممکن است به صورت مستقیم هم انجام شود.

۲-۲-۳- مری و چینه دان

- کرمهای چینه دان^[۱۰]

- گونه‌های کاپیلاریا^[۱۱]

این نماتودها چینه دان و مری را مبتلا می‌کنند کوچکترین انگل روده‌ای بوقمون می‌باشد. مخاط را سوراخ کرده و تونلی در آن ایجاد می‌نمایند وموجب التهاب وضخیم شدن مخاط می‌شوند. طول برخی از این کرم‌ها به ۶سانتی متر می‌رسد. این انگلها نازک و نخی شکل بوده، با چشم غیر مسلح بسختی دیده می‌شوند ولی درگسترش‌های تهیه شده ازمخاط، به آسانی دیده می‌شوند. ماکیان، بوقلمون، غاز، اردک، مرغ شاخدار و بسیاری از پرندگان وحشی یا پرندگان تفریحی محبوس، به این انگل حساسند، نشانه‌های بیماری اغلب شامل کم خونی و لاغری است (۸ و ۵).

۲-۲-۴- پیش معده

حداقل سه گونه از نماتودها (دیسفارینکس، تترامرز، سیرنه آ) به عنوان انگل پیش معده طیور وسایرپرندگان محسوب می‌شوند. شکل بالغ این کرمها ۳ تا ۱۸ میلی متر طول داشته، براحتی با چشم غیرمسلح دیده می‌شود. اکثر گونه‌ها تونلی درمخاط ایجاد کرده، برخی به طور عمقی در داخل غدد نفوذ می‌کنند. جراحات شامل زخم مخاط همراه با خونریزی، نکروز وتورم مخاط می‌باشد، که درنتیجه گاهی سبب مسدود شدن مجرا می‌گردد. نشانه‌ها متغیر وگاهی شامل اسهال، لاغری و کم خونی می‌باشند. ماکیان، بوقلمون، کبوتر، مرغ شاخدار، بلدرچین، اردک، باقرقره و قرقاول به این انگل حساسند. مرگ و میر بالا درکبوترها وبا قرقره‌های آلوده به دیسفارینکس ناسوتا اتفاق افتاده است. ملخ، سوسک و دو نوع ساس (سوباگ و پیل باگ) برای یک یاچند گونه از این کرمها، میزبان واسط می‌باشند.

۲-۲-۵- سنگدان

کرم‌های سنگدان

حداقل دوجنس از انگلها، (کیلوسپیرورا، آمیدوستوموم) سنگدان را مبتلا می‌کنند. انگلهای بالغ حدود ۱ سانتی متر طول دارند و طول آنها به ۴سانتی مترهم می‌رسد. اکثر اینها زیر پوشش سنگدان زندگی می‌کنند، ممکن است سنگدان دچار زخم و نکروز شده یا قسمتهایی از آن کنده شود. ممکن است دیواره عضلانی سنگدان حالت کیسه‌ای پیدا کند یا پاره شود. ماکیان، بوقلمون، اردک، غاز، بلدرچین و باقرقره به این انگل حساسند. ملخ، سوسک، شپشک میزبان‌های واسطه یک یا چندگونه از این کرمها می‌باشند.

۲-۲-۶- روده باریک

کرم‌های گرد^[۱۲] (گونه آسکاریدیا)^[۱۳]

گونه‌های بسیاری از آسکاریسها در روده باریک پرندگان شناسایی شده اند. اکثر آسکاریسها تنها یک گونه از پرندگان را مبتلا می‌کنند. این کرمها ، بویژه در پرندگان جوان، تورم روده ایجاد می‌کنند. نشانه‌های عفونت معمولأ شامل اسهال وکاهش وزن می‌باشد. پرندگانی که اغلب آلوده می‌شوند شامل : ماکیان، بوقلمون، بلدرچین (همه به آسکاریدیاگالی حساسند)،کبوتر ومرغ شاخدار می‌باشند. اگرچه تخم آسکاریس به وسیله ملخها و کرم‌های خاکی انتقال می‌یابند و ماکیان را آلوده می‌نمایند، ولی چرخه زندگی آنها معمولأ مستقیم است.

گونه‌های کاپیلاریا^[۱۴]

این کرمها مخاط روده پرندگان را مبتلا می‌کنند. بسیاری از کاپیلاریاها میزبان اختصاصی ندارند. اینها در مخاط روده باریک ویا روده کور زندگی می‌کنند. طول کرم‌های بالغ این گروه از ۶ تا ۲۵ میلی متر متغیر است، این کرمها بسیار نازک هستند. بهترین راه تشخیص این کرمها، استفاده از میکروسکوپ می‌باشد و معمولأ می‌توان آنهارا در گسترشهای تهیه شده از مخاط پرندگان مبتلا پیدا کرد. این کرمها با شدتهای مختلف موجب تورم روده می‌شوند. نشانه‌ها شامل اسهال، لاغری و احتمالأ مرگ می‌باشد. پرندگانی که معمولأ به این کرمها مبتلا می‌شوند عبارتند از : ماکیان،بوقلمون، کبوتر، مرغ شاخدار، اردک، غاز، قرقاول و بلدرچین. بعضی از کاپیلاریاها دارای میزبان واسط (کرم خاکی) و بعضی دیگر داری مسیر تکامل مستقیم هستند.

کرم‌های پهن^[۱۵]

جنس و گونه‌های زیادی از کرم‌های پهن وجود دارند که طیور و سایر پرندگان را مبتلا می‌کنند. بسیاری از این گونه‌ها میزبان اختصاصی ندارند. اکثر این کرمها به آسانی باچشم قابل مشاهده‌اند، درحالی که تعدادی از آنها کوچکند و به آسانی دیده نمی‌شوند. اکثر کرم‌های پهن به وسیله یک میزبان واسطه بی مهره (حشرات، خرچنگها، کرم‌های خاکی، حلزونها، زالوها )انتقال می‌یابند و با کنترل میزبانهای واسطه می‌توان آنها را کنترل کرد. کرمهای پهن، پرنده را از غذا بی بهره می‌کنند و ممکن است در محل اتصال به روده جراحت ایجاد نمایند. بیماری‌زایی آنها نامعلوم و احتمالأ متغیر می‌باشد و گاهی از میزانی که تصور می‌شود هم پایین تر است. کرم‌های پهن به ندرت در طیور مشکل ایجاد می‌کنند، مگر در پرندگانی که دارای چرای آزادند یا گله‌های کوچک خانگی، که در آنها میزبانهای واسطه حضور دارند. سوسک‌هایی که در بستر زندگی می‌کنند و مگسهای خانگی می‌توانند برای طیوری که به طور متراکم و محبوس پرورش می‌یابند به عنوان میزبان واسطه عمل نمایند.

۲-۲-۷- روده کور

هتراکیس گالیناروم در روده کور بسیاری ازطیور وسایر پرندگان زندگی می‌کند. این انگل به خوبی شناخته شده است زیرا ممکن است تخم آن حاوی تک یاخته (هسیتوموناس مله آگریدیس) عامل بیماری سرسیاه باشد. طول این کرم به ۵/۱ سانتی متر می‌رسد وبه آسانی قابل مشاهده می‌باشد واکثرأ در انتهای روده کور فراوان است. کرم موجب تورم روده کور می‌شود و ممکن است در دیواره روده کور ندول‌های کوچکی تشکیل دهد. پرندگان حساس شامل : ماکیان، بوقلمون، مرغ شاخدار، بلدرچین، اردک، قرقاول و غاز می‌باشند. چرخه زندگی انگل مستقیم بوده ونیازی به میزبان واسط ندارد. پس از خروج تخم‌ها همراه با مدفوع، در عرض ۲هفته یا کمتر به لارو عفونت‌زا تبدیل می‌شوند این تخم‌های عفونت‌زا ممکن است توسط پرندگان و با کرم‌های خاکی که بعدأ مورد تغذیه پرندگان قرار می‌گیرند، خورده شوند. پس از آن رویان‌های تخم‌ها در قسمت فوقانی دستگاه گوارش از تخم خارج شده و در عرض ۲۴ ساعت به سکوم که محل بلوغ آنهاست مهاجرت می‌کنند (۸ و ۳).

۲-۲-۸- پوست

کالیریکلوم فابا^[۱۶]

یک ترماتود نیمه کروی است،که طول آن به ۵/۵ میلی متر می‌رسد. این کرم درون کیستهایی در پوست طیور و بسیاری از پرندگان وحشی زندگی می‌کند. کیستهای پوستی حدود ۴ تا ۴ میلی متر قطر داشته، معمولأ حاوی دو کرم می‌باشند و اغلب در ناحیه مخرج دیده می‌شوند. چرخه زندگی آن ناشناخته است. این جراحات نشانه‌های زیادی ایجاد نمی‌کنند ولی ممکن است به کاهش کیفیت لاشه در کشتارگاه منجر گردد.

۲-۳- بیماری‌های انگلی طیور

۲-۳-۱- کوکسیدیوز

تعریف

کوکسیدیوز طیور از بیماری‌های تک یاخته‌ای طیور در تمام نقاط دنیا است. که باعث ایجاد التهاب روده می‌شود و کارائی پرندگان را کاهش می‌دهد.

تاریخچه

کوکسیدیوز از سالها پیش به عنوان یکی از بیماری‌های مهم طیور، بویژه ماکیان شناخته شده است. بسیاری از اطلاعات اساسی در مورد کوکسیدیوز در دهه‌ های ۱۹۳۰ و۱۹۴۰ حاصل شد وهنوز هم تحقیقات مهمی در این زمینه انجام می‌گیرد. همزمان با توسعه صنعت طیور در سراسر دنیا، گله‌های بزرگتری از پرندگان در محوطه‌های محدود تری پرورش یافتند، که این وضعیت سبب افزایش شیوع کوکسیدیوز گردید. کسب دانش بیشتر درباره کوکسیدیا و تولید داروهای ضدکوکسیدیایی موثر، پیشگیری از خسارات زیادی را که قبلأ رایج بوده، ممکن ساخته است. امروزه کوکسیدیوز در اغلب واحدهای بزرگ پرورش طیور به خوبی کنترل می‌شود، ولی در جاهایی که معیارهای کنترل بیماری به کارگرفته نمی‌شود به صورت بیماری مهمی باقی می‌ماند (۸).

سبب شناسی

کوکسیدیوز در ماکیان و بوقلمون به وسیله گونه‌هایی از ایمریا ایجاد می‌شود. گونه‌های متعددی از آیمریا هادر ماکیان و بوقلمون وجود دارند ولی همه آنها بیماری‌زایی شدیدی ندارند. کوکسیدیاها دارای میزبان‌های اختصاصی می‌باشند، از این رو بین گونه‌های مختلف طیور انتقال نمی‌یابند (۵).

هفت گونه آیمریا عبارتنداز : آیمریا ادنوئیدس، آیمریا مله اگریدیس، آیمریا گالوپاوونیس،آیمریا مله اگریمیتیس، آیمریا دیسپرسا، آیمراینکوآ و آیمریا سابروتوندا. غالبأ ۳گونه اول در بوقلمون بیماری‌زا هستند (۳).

چندین گونه در مزارع بوقلمونهای تجاری در سراسرایالات متحده آمریکایافت شده است (۱۴).

انتقال

عامل بیماری‌زا برخلاف سایر ارگانیسم‌ها از پرنده‌ای به پرنده دیگر منتقل نمی‌شود. پرندگان با خوردن اووسیت‌های هاگ دار شده که با مدفوع پرندگان بیماری دفع می‌گردند و بستر، آب و غذا را آلوده می‌کنند مبتلا می‌شوند (۳).

نشانه‌های بالینی

نشانه‌های بیماری در ماکیان برحسب گونه‌های مختلف کوکسیدیا متفاوت است. گونه‌هایی که بیماری‌زایی کمی دارند، یافاقد نشانه اند یا نشانه‌های کمی ایجاد می‌کنند. گونه‌هایی که بیماریزایی بیشتری دارند، اغلب موجب اسهال می‌گردند که ممکن است موکوئیدی یاخونی باشد. غالبأ به همراه اسهال ، دهیدراتاسیون به وجود می‌آید. متعاقب اسهال و دهیدراتاسیون، بزودی ژولیدگی پرها، کم خونی ، بی حالی، ضعف،جمع کردن سرو گردن به طرف بدن و خواب آلودگی بروز می‌کند.

کوکسیدیوز در مرغ‌های تخم گذار معمولأ با کاهش تولید تخم مرغ مشخص می‌گردد. در صورت استقرار کامل عفونت، ممکن است از دست دادن رنگدانه‌های پوست نیز مشاهده شود. آلودگی پرندگان در حال رشد بویژه جوجه‌های گوشتی باعث می‌شود که رشد مناسب آنها سریعأ متوقف شود. میزان واگیری و مرگ و میر در ماکیان بسیار متغیر است ولی ممکن است هر دو بسیار بالا باشند. کوکسیدیوز در بوقلمون نیز شبیه این بیماری در ماکیان است اما اسهال بندرت خون آلود می‌شود و ابتلای شدید بوقلمون‌های جوان در سنین ۸ هفتگی به بالا بندرت اتفاق می‌افتد (۸).

جراحات

به منظور تشخیص ضایعات کوکسیدیوز می‌توان آنها را بر حسب ابتلای ثلث قدامی، میانی و خلفی روده‌ها تقسیم بندی نمود. نوع و محل جراحات ایجاد شده در روده و بیماری‌زایی انگل بدین ترتیب است :

ثلث قدامی

آیمریا آسرولینا : موجب تورم روده در ثلث قدامی روده‌ها می‌شود. در موارد شدید ممکن است جراحات به قسمت‌های پایین تر روده هم گسترش یابند. تورم روده ممکن است خفیف تا شدید باشد و گاهی منجر به ضخیم شدن مخاط می‌گردد. خطوط (پلاک های) عرضی سفید تا خاکستری اغلب در مخاط مشاهده می‌گردند ولی اگر به هم متصل شوند، ممکن است قابل تشخیص نباشند. در گسترش‌های تهیه شده از مخاط، اووسیت‌ها دارای اندازه متوسط و به شکل تخم مرغ می‌باشند. این نوع کوکسیدیوز در پرندگان مسن تر شایع است. آیمریا آسرولینا بیماری‌زایی نسیتأ شدیدی دارد. حضور گونه‌های مختلف آیمریا، معمولأ تشخیص را دشوار می کند.

ثلث میانی

آیمریا نکاتریکس : سبب تورم شدید روده در ثلث میانی، ودر موارد شدید در سرتاسر روده می‌شود. تورم روده اغلب با پرخونی، خونریزی، نکروز و مدفوع خون آلود مشخص می‌گردد. ثلث میانی روده اغلب به طور مشخصی متسع، ملتهب و ضخیم می‌گردد. کانون‌های سفید تا زرد (شیزونت‌های بسیار بزرگ) وخونریزی‌های پتشی ممکن است در سطح سروزی روده‌ای که باز نشده، مشاهده شوند. اووسیت‌ها فقط در روده کور تشکیل می‌گردند و تعداد آنها زیاد نیست، علاوه بر این، ممکن است پیش از حضور اووسیت‌ها در مدفوع، پرندگان بمیرند.

آیمریا نکاتریس بیماری‌زایی شدیدی دارد و اغلب موجب مرگ و میر بالایی می‌شود.

آیمریا ماکزیما : تورم ملایم تا شدیدی را درثلث میانی روده‌ها ایجاد می‌کند که گاهی با ضخیم شدن دیواره روده و اتساع مشخص آن همراه می‌باشد. محتویات ممکن است خون آلود باشد. اووسیت‌ها بسیار بزرگ واغلب به رنگ طلایی می‌باشند. آیمریا ماکزیما بیماری‌زایی متوسط تا شدیدی دارد.

ثلث خلفی

آیمریابرونتی : در ثلث خلفی روده‌ها (انتهای روده باریک، رکتوم و قسمت ابتدایی روده کور) تورم ایجاد می‌کند. ممکن است توده فیبرینی یا فیبرینی نکروتیکی از بقایای سلولی، مخاط مبتلا را بپوشاند یا توده پنیری شکلی در روده کور و رکتوم ایجاد نماید. اووسیت‌های بزرگ هستند وهرکدام دارای یک گرانول قطبی می‌باشند. آیمریا برونتی بیماری‌زایی نسبتأ شدیدی دارد.

آیمریا تنلا : موجب تورم مشخص روده کور وگاهی ابتلای نواحی دیگر روده می‌شود. غالبأ در ابتدا خون در روده کور و مدفوع ظاهر می‌شود. بعدأ ممکن است توده‌ای پنیری در روده کور یافت شود. شیزونت‌های بزرگی در روده کور وجود دارند. آیمریا تنلا بیماری‌زایی شدیدی دارد و در جوجه‌های جوان مرگ ومیر بالایی ایجاد می‌کند.

۲-۳-۲- کریپتوسپوریدیوز

کریپتوسپوریدیوز نوعی بیماری تک یاخته‌ای است که در پرندگان با ایجاد بیماری حاد یا مزمن در دستگاه‌های تنفس وگوارش مشخص می‌گردد. البته بعضی از عفونتهای کریپتوسپوریدیایی نشانه خاصی ندارند. این ارگانیسم دارای یک چرخه زندگی کوکسیدیایی می‌باشد که در لبه پرزهای کوچک سلول‌های اپی تلیال کامل می‌گردد.

وقوع بیماری

عفونت با کریپتو سپوریدیوم در ماکیان، بوقلمون، بلدرچین، قرقاول، طاووس، طوطی وپرندگان آبزی رخ می‌دهد. انسان و سایر گونه‌های پستانداران، خزندگان، دوزیستان وماهیها نیز ممکن است با این تک یاخته آلوده شوند. در میزبان‌هایی که ایمنی آنها تضعیف شده، کرپتوسپوریدیوز ممکن است بیماری شدید و مهلکی ایجاد نماید، ولی تضعیف ایمنی، لازمه ایجاد عفونت یا بیماری نیست.

دوگونه معتبر از کریپتوسپوریدیوم در بوقلمونها یافت شده است که شامل C.meleagridis و C.baileyi (36).

تاریخچه

۱- Tyzzer در سال ۱۹۰۷ اولین بار آلودگی موش آزمایشگاهی با کریپتوسپوریدیوم را توصیف نمود. بعدأ او دو گونه از کریپتوسپوریدیومهای آلوده کننده موش را براساس محل اختصاصی و مرفولوژی ارگانیسم مشخص نمود :کریپتوسپوریدیوم موریس (مخاط معده) وکریپتوسپوریدیوم پارووم (روده کوچک) (۴۰).

۲- همچنین Tyzzer اولین کسی بود که درسال ۱۹۲۹، آلودگی با کریپتوسپوریدیوم را در روده کور ماکیان شرح و گزارش داد، ولی هیچ نشانه‌ای ازبیماری توجه او را جلب نکرد. اولین گزارش از واگیری و مرگ و میر ناشی از کریپتوسپوریدیوم در پرندگان در سال ۱۹۵۵ و مربوط به ابتلای قسمتهای انتهایی روده باریک بوقلمونها بود. اولین گزارش کریپتوسپوریدیوز تنفسی در گونه‌های مختلف پرندگان، شامل بوقلمون نیز بود (۸،۱۸) و چندین گزارش کریپتوسپوریدیوز تنفسی شدید در بوقلمونهای تجاری نیز وجود دارد (۱۶،۳۵،۳۹).

سبب شناسی

۱- براساس جایگاه ویژه بافتی ومورفولوژی ارگانیسم دو گونه کریپتوسپوریدیوم در پرندگان مشخص شده اند : کریپتوسپوریدیوم مله آگریدیس که در شرایط طبیعی تنها روده باریک را مبتلا می‌کند و کریپتوسپوریدیوم بایلئی که دستگاه گوارش (بخصوص بورس فابرسیوس و کلوآک) وگاهی دستگاه تنفسی را مبتلا می کند.

۲- مشاهدات درمانگاهی و مطالعات تجربی بیانگر آن است که هیچ یک از گونه‌های کریپتوسپوریدیوم پرندگان، پستانداران از جمله انسان را آلوده نمی‌سازد، بنابراین از نظر بهداشت عمومی، هیچ خطر شناخته شده‌ای ندارند. گونه‌های کریپتوسپوریدیوم پستانداران گاهی بیماری مشترک بین انسان و دام ایجاد می‌کنند و در این مورد انتقال بیماری از حیوان به انسان به خوبی ثابت شده است.

همه گیر شناسی

کریپتوسپوریدیوم، کوکسیدیوم کوچکی است که در موقعیت داخل سلولی ولی خارج سیتوپلاسمی، درست در غشای لبه مژه دار سلولهای اپی تلیال میزبان تکثیر می‌یابد. اووسیت‌ها پس از ایجاد وارد محیط خارج سلولی می‌شوند، و زمانی که در مدفوع یا ترشحات قسمت فوقانی دستگاه تنفس دفع می‌شوند، عفونت‌زا هستند.

نشانه‌های بالینی

۱- نشانه‌های بالینی کریپتوسپوریدیوز مختص این بیماری نیست ومعمولأ عوامل بیماری‌زای دیگری نیز این نشانه‌ها را ایجاد می‌کنند. ابتلای روده باریک باعث اسهال می‌شود که ممکن است در بوقلمونهای جوان، بلدرچین وطوطی سانان مهلک باشد. در بلدرچین‌های جوان ممکن است مرگ و میر تا ۹۵ درصد افزایش یابد. ممکن است عفونت‌های گوارشی درجوجه‌های گوشتی باعث کاهش رنگدانه‌های لاشه گردد.

۲- نشانه‌های کریپتوسپوریدیوز تنفسی متناسب بامحل عفونت می‌باشد. ترشح از چشم، بینی، تورم سینوسها، سرفه، تنگی نفس، نفس نفس زدن، عطسه و صداهای تنفسی وجود دارد. ممکن است عفونت‌های عمقی ریه و کیسه‌های هوایی اتفاق افتاده، سبب مرگ و میر شود. عفونت همزمان با سایر عوامل بیماری‌زای تنفسی متداول می‌باشد (۸،۳۵،۳۹).

جراحات

۱- کریپتوسپوریدیوز روده باریک باعث اتساع روده همراه با تجمع محتویات آبکی در آن می‌شود. روده کور نیز ممکن است منبسط ودارای محتویات آبکی و کف آلود باشد. جراحات بافت شناسی شامل کوتاه شدن خملها همراه با نکروز و از بین رفتن سلولهای روده‌ای در ناحیه رأس خمل و حضور تعداد زیادی ارگانیسم در لبه مژه دار اپی تلیوم مخاطی می‌باشد. ارگانیسم‌ها همچنین در مخاط تونسیل‌های روده کور و درمخاط بورس فابرسیوس و کلو آک یافت می‌شوند. ممکن است اپی تلیوم مخاط بورس، هیپرپلاستیک و حاوی تعدادی هتروفیل باشد.

۲- کریپتوسپوریدیوز تنفسی باعث ایجاد اکسودای موکوسی خاکستری یا سفیدی بر روی سطوح مخاطی مبتلا در ملتحمه، سینوس‌ها، بوقک‌های بینی، نای، برونش‌ها و کیسه‌های هوایی می‌شود. در بوقلمون ممکن است حجم سینوسهای تحت حدقه‌ای به طور مشخصی افزایش یابد. عفونتهای ریوی ممکن است سفت شدن ریه‌ها و ایجاد رنگ خاکستری در آنها گردد.

تشخیص

۱- در بیشتر موارد، کریپتوسپوریدیوز را می‌توان با انجام آزمایش‌های بافت شناسی بر روی نمونه‌های بیوپسی شده با بافتهای جمع آوری شده در کالبدگشایی تشخیص داد. دررنگ آمیزی با هماتوکسیلین _ائوزین، این ارگانیسم بازوفیلیک بوده، ۲ تا ۴ میکرون قطر دارند و با لبه‌های مژه دار مخاط ارتباط نزدیکی دارند.

۲- از نظر سیتولوژی می‌توان جهت تأیید تشخیص استفاده نمود. گسترشهای تماسی سطوح مخاطی را می‌توان به وسیله یک میکروسکوپ فازکنتراست یا فاز کنتراست متعارض مورد آزمایش قرار داد. همچنین می‌توان این گسترشها را بعد از خشک شدن در هوا، با رنگ کربن فوشین قرمز یا گیمسا رنگ آمیزی کرد.در رنگ آمیزی با گیمسا ممکن است لازم باشد که آنها را از مخمرها متمایز نمود.

۳- برای مشخص نمودن اووسیت در نمونه‌های مدفوع، از تکنیک‌های شناورسازی در محلول‌های Sather’s sucrose، سولفات روی (۳۳ درصد تا اشباع) و کلرید سدیم (۳۶ درصد تا اشباع) استفاده می‌شود.

اووسیت‌ها ۴ میکرون قطر دارند ودارای دیواره سلولی ضخیم ، یک جسم باقی مانده برجسته و اجسام متراکم کروی کوچکتر و اسپوروزوئیت‌های هلالی می‌باشند.

۴- عوامل بیماری‌زای رایج دستگاه تنفس که با کریپتوسپوریدیوز تنفسی همراه بوده‌اند، شامل اشریشیا کلی، پاستورلا مولتوسیدا، ویروس بیماری نیوکاسل، آدنو ویروس‌ها، ویروس برونشیت عفونی و رئوویروسها می‌باشند.

۵- بسیاری از طیور گوشتی مبتلا به کریپتوسپوریدیوز بورس، به بیماری گامبورو نیز مبتلا بوده اند ولی این حالت برای بیماری‌زا بودن آن لازم نیست. در سایر پرندگان نیز ممکن است، بیماری‌های سالمونلوز، کاندیدیازیس، هپاتیت ویروسی بوقلمون، عفونت‌های رئو ویروسی روده‌ها و سایر انگلها با بیماری کریپتوسپوریدیوز همراه شوند.

۲-۳-۳- هگزامیتیازیس

تعریف

هگزامیتیازیس از بیماری‌های تک یاخته‌ای بوقلمونهای جوان، اردک‌ها، کبوتر، طاووس و بسیاری از پرندگان تفریحی می‌باشد که با تورم نزله‌ای روده و اسهال آبکی یا کف آلود مشخص می‌گردد.

وقوع بیماری

هگزامیتیازیس معمولأ در بوقلمونهای جوان در سن ۱ تا ۹ هفتگی و بخصوص در پرندگانی که در دوره‌های بعد نیز با همان امکانات پرورش داده می‌شوند، دیده می‌شود. بوقلمونهای مسن تر غالبأ، حاملهای پنهان بیماری می‌باشند. هگزامیتیازیس همچنین در پرندگان تفریحی (قرقاول، بلدرچین، نوعی کبک و غیره)، طاووس و اردک بروز می‌کند. کبوتر‌ها به شکل متفاوتی از بیماری هگزامیتیازیس مبتلا می‌گردند. وقوع بیماری در بسیاری از کشورها گزارش شده است. این بیماری معمولأ در ماه های گرمتر سال و در محل‌هایی که پرورش بوقلمون با استانداردهای ضعیف بهداشتی انجام می‌شود، رخ می‌دهد. امروزه میزان بروز هگزامیتیازیس کاهش یافته است.

تاریخچه

۱- تا چندین سال هگزامیتیازیس با تریکومونیازیس اشتباه می‌شد. درسال ۱۹۳۸ Hinshaw و سایرین برای اولین بار هگزامیتیازیس و عامل ایجاد کننده آن را بوضوح مشخص نمودند.

۲- در ابتدای پیشرفت صنعت پرورش بوقلمون، خسارات وسیعی را به هگزامیتیازیس نسبت می‌دادند. با این وجود به نظر نمی‌رسد که میزان بروز این بیماری با گسترش صنعت پرورش بوقلمون افزایش یافته باشد.

۳- امروزه وقوع هگزامیتیازیس بندرت گزارش می‌شود. ممکن است پیشرفت اقدامات بهداشتی و مدیریتی در مزارع پرورش بوقلمون میزان بروز بیماری را کاهش داده باشد. داروهای شیمیایی ضد هیستوموناس که به طور معمول برای کنترل بیماری سر سیاه استفاده می‌شوند، می‌توانند هگزامیتیازیس را هم کنترل نمایند.

سبب شناسی

۱- عامل ایجاد کننده بیماری در بوقلمونهای جوان و بیشتر پرندگان حساس دیگر هگزامیتا مله اگریدیس می‌باشد. این تک یاخته با ابعاد تقریبی ۳×۹ میکرون، دارای ۸ تاژک و ۲ هسته شبیه به چشم می‌باشد. این انگل به طور سریع و جهشی حرکت می‌کند. عامل ایجاد کننده این بیماری در کبوترها هگزامیتا کولومبه است.

۲- هگزامیتا مله اگریدیس در فرورفتگیهای لیبرکون، خصوصأ در دوازدهه وابتدای ژوژنوم پرندگان مبتلا وهمین طور حاملهای مسن تر یافت می‌گردد. درعفونتهای فعال ممکن است تعداد تک یاخته‌ها بسیار زیاد باشد.

همه گیری شناسی

۱- پرندگان بهبود یافته حاملهای بیماریند و با دفع انگل همراه مدفوع، موجب آلودگی آب، غذا ومرتع می‌گردند. پرندگان حساس، انگل را از طریق بلع دریافت می‌کنند. انتقال بین گونه‌ها، مثلأ از پرندگان تفریحی به بوقلمونهای جوان براحتی صورت می‌گیرد. این طرز انتقال در مورد بوقلمونهای جوان در مرتع بسیار محتمل است.

۲_زمانی که در جوجه ریزیهای متوالی، جوجه بوقلمونها در همان مکان پرورش یابند، خصوصأ درموارد ضعیف بودن بهداشت، به نظر می‌رسد که تعداد هگزامیتاها در هر جوجه ریزی افزایش می‌یابد و نشانه‌های بیماری در جوجه ریزی‌های بعدی ظاهر می‌شوند.

نشانه‌های بالینی

۱- پرندگان مبتلا در ابتدا پر جنب و جوش و عصبی هستند، آنها بیش از حد جیک جیک می‌کنند، می‌لرزند، دور منبع حرارتی جمع می‌شوند و دمای بدنشان زیر حد نرمال است. اسهال آبکی یا کف آلود مشاهده می‌شود و پرندگان به سرعت دچار دهیدراتاسیون می‌گردند.

۲- مدتی بعد پرندگان کسل‌تر می‌شوند و در حالت ایستاده، سر را به طرف بدن جمع می‌کنند، پرها ژولیده و بالها آویزان می‌شوند. نهایتأ پرندگان به حال اغما در آمده، دست و پا می‌زنند و می‌میرند. به نظر می‌رسد که نشانه‌های نهایی مربوط به کاهش قندخون باشد.

۳- میزان ابتلا به بیماری بالاست. میزان مرگ و میر متناسب با سن و کیفیت امکانات پرورشی متغیر است. گاهی میزان مرگ و میر در پرندگان جوانی که تحت شرایط نامناسبی نگهداری شده و هرگز درمان نشده‌اند، بسیار بالا (۷۵درصدتا۹۰ درصد) می‌باشد.

جراحات

لاشه دهیدراته می‌باشد. روده‌ها نرم می‌شوند وممکن است در بعضی مناطق، اتساع حبابی شکل داشته، حاوی مقدار زیادی موکوس و گاز باشند. معمولأ نیمه قدامی روده ملتهب می‌گردد. ممکن است تونسیل‌های روده کور پرخون شوند.

تشخیص

۱- تاریخچه، نشانه‌های بالینی وجراحات کالبدگشایی براین بیماری دلالت می‌نمایند ولی باید از تورم روده مسری، عفونت پاراتیفوئیدی، تریکومونیازیس و بیماری سر سیاه متمایز شود.

۲- باید با بهره گرفتن از میکروسکوپ فازکنتراست یا با کاهش نور، گسترش تهیه شده از دوازدهه یک پرنده مبتلا را که به تازگی کشته شده است مورد آزمایش قرار داد. مشاهده تعداد زیادی هگزامیتا در قسمت ابتدایی روده دلالت بر هگزامیتیازیس دارد. اگر لاشه پرندگانی را که تازه مرده اند در اختیار داشته باشیم، ممکن است با سالین گرم به گسترش تهیه شده، هگزامیتا تا حد کفایت برای تشخیص، به حرکت درآیند. هگزامیتای مرده به سختی تشخیص داده می‌شود، بنابراین بهتر است که جهت کالبدگشایی پرندگان زنده در اختیار داشته باشیم.

۲-۳-۴- هیستومونیازیس

سرسیاه ^[۱۷]

انتروهپاتیت ^[۱۸]

تعریف

هیستومونیازیس نوعی بیماری تک یاخته است که به وسیله هیستوموناس مله آگریدیس ایجاد می‌شود و بوقلمون، ماکیان، طاووس، باقرقره، بلدرچین و احتمالأ سایر پرندگان را مبتلا می‌کند و از طریق ایجاد ضایعات نکروتیک در کبد و روده کور مشخص می‌گردد.

وقوع بیماری

هیستومونیازیس بیشتر اوقات در بوقلمونها، بویژه در سنین زیر ۳ ماهگی، در صورت مواجهه با انگل وعدم مصرف دارو، بروز می کند.

مطالعاتی وجود دارند که نشان می‌دهند که سن پرنده،یکی از عوامل موثر در بروز بیماری است.

طی بررسی انجام شده توسط Curtice (1907) نشان داده شد که ۹۰ درصد از جوجه بوقلمون‌های محبوس در یک منطقه مبتلا به بیماری شدند در حالی که درهمان منطقه تنها ۲۰ درصد بوقلمون‌های پیر آلوده شدند (۱۱) با این حال Kendall (1957) نشان داد تفاوت معنا داری در استعداد ابتلا به این بیماری در بوقلمون‌های ۷ هفته تا ۲۰ ماهه که به صورت آزمایشگاهی آلوده به عامل هیستومونیازیس شده بودند، وجود ندارد (۲۱).

طی مطالعاتی که توسط Milks (1908)، Ohara و همکاران (۱۹۶۱) و Desowitz (1951) صورت گرفت نشان داده شدکه بروز هیستومونیازیس در جوجه‌ها، شدیدتر ازپرندگان جوانتر است (۳۰،۳۱،۱۳).

این بیماری همچنین در ماکیان، بخصوص جوجه‌های گوشتی و نیز در بسیاری از پرندگانبه وقوع می‌پیوندد و باعث اختلالات عملکردی در سکوم و کبد می‌شود. پرندگان جوان بیشتر و شدیدتر مبتلا می‌شوند. درمناطقی که کرم خاکی وجود ندارد، وخاک آن شنی و خشک است و نیز در جاهایی که ناقلی برای انتقال هیستوموناد وجود ندارد، وقوع بیماری شایع نیست. درجاهایی که تمهیدات مناسبی برای پیشگیری از هیستومونیازیس به کار گرفته می‌شود، وقوع بیماری معمول نیست (۸ و ۴۱).

هتراکیس گالیناروم به عنوان ناقل هیستومونیازیس می‌تواند انتقال بیماری هیستومونیازیس از پرندگان یک گونه به همان گونه یا گونه‌های دیگر را موجب شود (۲۵،۲۶،۲۷،۲۸،۳۴).

تاریخچه

۱- هیستومونیازیس در بوقلمونها برای اولین بار در سال ۱۸۹۵ توصیف شد. زمانی هیستومونیازیس مانعی برای گسترش صنایع پرورش بوقلمون محسوب می‌شد به طوری که در سال ۱۹۴۵ در کارولینای شمالی باعث ۲/۳۲ درصد مرگ و میر در بوقلمونها شد. قبل از تولید داروهای ضد هیستوموناس بی خطر و سالم، این بیماری تنها به وسیله روش های نسبتأ غیر موثر و پرزحمتی کنترل می‌شد که برای پیشگیری از مواجهه بوقلمونها با تخمهای جنین دار کرمهای روده کور (هتراکیس گالیناروم) طرح ریزی شده بود (۸،۹،۱۲).

۲- بعد از تولید داروهای ضد هیستوموناس بی خطر و سالم، صنعت پرورش بوقلمون به رشد چشمگیری دست یافت. این بیماری امروزه شایع نیست و این داروها دیگر به صورت روزمره استفاده نمی‌شوند. وقتی بوقلمونها را در محلی پرورش دهند که قبلأ محل نگهداری ماکیان بوده است، بیماری به طور انفرادی رخ می‌دهد. این بیماری هنوز در ماکیان متداول است ولی تاثیر خفیفی روی تولید دارد و بندرت تشخیص داده می‌شود. هیستومونیازیس هنوز به عنوان یک عامل مهم مرگ و میر در بین سایر پرندگان خانواده گالی فرم مانند طاووس، قرقاول و بلدرچین تلقی می‌شود و در دهه‌ های اخیر باعث آسیب جدی به ماکیان صنعتی به خصوص در میان بوقلمون شده است (۸،۱۷).

سبب شناسی

۱ین تک یاخته به چند فرم دیده می‌شود :

۱- مهاجم^[۱۹]

۲-وجتاتیو^[۲۰]

۳- مقاوم^[۲۱]

۴- Flagallate

فرم مهاجم در ابتدای روده کور دیده می‌شود. فرم ساکن در مراحل پیشرفته تر در جراحات دیده می‌شود. مرحله‌ای که در روده دیده می‌شود آمیبی شکل است و ۵-۳۰µ است و اکتوپلاسم واضحی دارد، این فرم مهاجم است. انگل به صورت دوتایی تکثیر حاصل می‌کند. این فرم Vagetative به بافت حمله می‌کند و تاژک ندارد و اندازه اش ۸-۱۵µ است. فرمی که مقاوم است در حدود ۱۱-۱۴µ است و واجد دیواره سلولی ضخیمی است. سیتوپلاسم آن قلیایی است و واجد دانه‌های متعددی است. مرحله‌ای که دروت بافت دیده می‌شود فاقد تاژک است. انگل جزء تاژکدارانی است که نفوذ داخل سلولی دارند.

سیرتکاملی

در طبیعت نماتود هتراکیس گالیناروم این تک یاخته را می‌خورد وتک یاخته به تخمدان هتراکیس می‌رود. این تک یاخته توسط تخم هتراکیس وارد محتویات روده می‌شود و به خارج راه پیدا می‌کند وبه وسیله میزبان دیگر خورده می‌شود و هیستوموناس آزاد می‌شود و سبب عفونت می‌شود.

کرم خاکی میزبان انتقالی است. انگل در بدن کرم خاکی به همان صورت باقی می‌ماند تا ماکیان از آن استفاده کنند. از مدفوع تازه دفع شده و هم ممکن است انتقال صورت گیرد.

بیماری‌زائی :

مخصوص بوقلمون‌های جوان است. در روده کور وقتی انگل آزاد می‌شود در مجرا تقسیم دوتایی کرده و بعد به مخاط روده حمله می‌کند. مخاط روده ضخیم شده و رفته رفته جراحات پیشرفته تر می‌شود. در سکوم خون ریزی پتشی می‌بینیم که بعد گسترده شده و بعد پرخون می‌شود. تک یاخته به زیر مخاط رفته و از طریق گردش خون و سیستم باب به کبد می‌رود. نکروز‌های کانونی در سطح کبد به صورت ماکروسکوپ لکه‌های زردی که به وسیله خطوط سبز مایل به زرد احاطه می‌شود. ضایعات ممکن است گسترده شوند و لکه‌ای به قطر ۱سانتی متر در سطح کبد دیده می‌شود.

نشانه‌های بالینی

۱- ۷تا ۱۲ روزبعداز مواجهه با انگل، بیماری ظاهر می‌شود. در ابتدا بی حالی، بی اشتهایی خفیف، آویختگی بال و مدفوع زرد (گوگردی) رنگ وجود دارد. سرهاممکن است سیانوزه شود (سرسیاه)، اگرچه غالبأ این طور نیست. در ماکیان مبتلا به هیستومونیازیس ممکن است مقداری خون در مدفوع وجود داشته باشد.

۲- سپس بوقلمون مبتلا کسل می‌شود و در حالی که بالها را آویخته، چشمها را بسته و سر را نزدیک بدن نگه می‌دارد، می‌ایستد. لاغری مفرط در موارد مزمن و معمولأ در پرندگان مسن تر، شایع می‌باشد.

۳- در بوقلمون‌های جوان میزان واگیری و مرگ و میر بالا است وتا ۱۰۰ درصد می‌رسد. پرندگان مسن تر مقاومت بیشتری نشان می‌دهند.

جراحات

جراحات مشخصی که به خوبی بیانگر این بیماری‌اند، عبارتند از :

۱- هر دو شاخه روده کور، بزرگ و دیواره آن ضخیم می‌گردد. مخاط معمولأ قرحه دار می‌باشد. روده کورمعمولأ حاوی توده پنیری زرد، خاکستری یا سبز و بعضأ لایه لایه می‌باشد. در موارد مزمن ممکن است این توده پنیری خارج شده باشد. در بلدرچین،حتی در صورت بالا بودن مرگ و میر ممکن است در روده کور جراحاتی ایجاد نشود. در صورت سوراخ شدن دیواره کور تورم صفاق رخ می‌دهد.

۲- کبد دارای جراحات گرد نامنظم و فرورفته و به رنگهای متفاوت می‌باشد. این جراحات اغلب زرد تا خاکستری هستند ولی ممکن است سبز یا قرمز باشند. قطر آنها بسیار متفاوت است ولی اغلب ۱ تا ۲سانتی متر می‌باشد وممکن است با پیوستن به یکدیگر جراحات بزرگتری را ایجاد نمایند.

۳- در پرندگانی که تحت درمان قرار دارند و در گونه‌هایی از پرندگان که حساسیت کمتری دارند یا در بوقلمونهای جوانی که در مراحل ابتدایی بیماری هستند ممکن است جراحات کاملأ مشخص نباشند. در گله‌های آلوده اگر تعداد پرندگان موردآزمایش،کافی باشد معمولأ جراحات واضحی یافت می‌شود.

۴- در بررسی میکروسکوپی، هیستومونادها در دیواره‌های متورم روده کور و در کانونهای نکروتیک ایجاد شده در کبد مشاهده می‌شوند.

تشخیص

معمولأ می‌توان با مشخص نمودن جراحات واضح در تعداد کمی از پرندگان به تشخیص رسید. در پرندگانی که جهت کالبدگشایی کشته می‌شوند، گاهی می‌توان عامل بیماری را در گسترش تهیه شده از روده کور، یا گسترشهای تهیه شده از حاشیه جراحات کبدی مشخص نمود. در مقاطع بافت شناسی تهیه شده از ضایعات کبدی و با رنگ آمیزی مناسب، می‌توان هیستوموناد را تشخیص داد.

۲-۳-۵- لکوسیتوزئونوز

تعریف

لکوسیتوزئونوز بیماری حاد یا مزمن پرندگانی مانند بوقلمون، اردک، غاز، مرغ شاخدار و ماکیان می‌باشد و به وسیله تک یاخته‌هایی ایجاد می‌شود که در سلولهای خونی و بسیاری از بافتهای دیگر تکامل می‌یابند.

وقوع بیماری

۱- این بیماری در انواع بسیاری از پرندگان وحشی (شامل بعضی از بوقلمونها، غازها و اردکها) بروز می‌کند، ولی معمولأ از نظر بالینی آشکار نیست. واگیریهای حاد گاهی در انواع اهلی بوقلمونها، غازها، اردکها، مرغهای شاخدار و ندرتأ در ماکیـان رخ می‌دهند. اکثر واگیریهای حــاد بیماری در طیـور جـوان اتـفاق می‌افتند در حالی که شکل مزمن بیماری معمولأ در پرندگان مسن تر(در گله مادر) به وقوع می‌پیوند.

۲- درطیور اکثر واگیریها در فصلهای گرم سال که پشه‌های سیاه فراوان ترهستند، رخ می‌دهند. واگیریها معمولأ در مرغداریهایی که نزدیک نهرهای آب، دریاچه‌های کم عمق یا نزدیک نواحی باتلاقی هستند اتفاق می‌افتند.

۳- در ایالات متحده لکوسیتوزئونوز در ایالتهای جنوب غربی و در مینه سوتا و ویسکانسین شیوع بیشتری دارد. تنها چند گزارش در مورد این بیماری در سایر کشورها وجود دارد. به هرحال ممکن است بیماری از آنچه انتظار می‌رود شایعتر باشد، زیرا پرندگان آبزی وحشی مهاجرت می‌نمایند و می‌توان انتظار داشت که باعث بیمار شدن پرندگان آبزی اهلی گردند.

تاریخچه

لکوسیتوزئونوز سالها پیش تشخیص داده شده است. یکی از اولین گزارشها توسط دکتر Theobald smith ارائه شد، او بروز بیماری را در سال ۱۹۸۵ در بوقلمون گزارش کرد. بعضی از نشانه‌های اولیه لکوسیتوزئون‌ها در پرندگان وحشی دیده شد. گزارشهای نسبتأ کمی از لکوسیتوزئونوز در پرندگان اهلی در دهه اخیر وجود دارد.

سبب شناسی

۱- عامل بیماری، لکوسیتوزئون‌ها هستند که ممکن است طبقه بندی آنها دقیق نباشد. بعضی از گونه‌های این تک یاخته ممکن است بیش از یک گونه از پرندگان را مبتلا نمایند در حالی که سایر لکوسیتوزئون‌ها تنها یک گونه را مبتلا می‌کنند. اسامی رایجی که به کار می‌روند شامل : لکوسیتوزئون اسمیتی (بوقلمونها)، لکوسیتوزئون سیموندی (اردک) لکوسیتوزئون نیوئی (مرغ شاخدار) و لکوسیتوزئون اندروزی (ماکیان) می‌باشند.

۲- گامت‌ها معمولأ داخل لکوسیت‌ها یا اریتروسیت‌های تخریب شده، یا در هر دو نوع این سلولها مشاهده می‌شوند. تکثیر به طریق شیزوگونی فقط در اندامهای داخلی میزبان انجام می‌شود. اسپوروگونی در یک دیپتروس خونخوار به عنوان میزبان واسط اتفاق می‌افتد. پشه‌های سیمولید و کولیکوئید نیز به عنوان میزبانهای واسط عمل می‌نمایند. به نظر می‌رسد که پرندگان تنها میزبان اکثر لکوسیتوزئون‌ها باشند.

همه گیر شناسی

پرندگان اهلی و وحشی که از بیماری جان سالم به در برده اند حاملهای پنهان لکوسیتوزئون‌ها در فصل زمستان می‌باشند. طی فصول گرم پشه‌های سیاه (سیمولیده) و پشه‌های کوچک (کولیکوئیدها) از سطح بدن حاملها تغذیه کرده، لکوسیتوزئون‌ها را دریافت می‌کنند. انگلها درون حشرات محتمل اسپوروگونی شده و به غدد موجود در محوطه دهانی آنها وارد می‌شوند. سپس حشرات به عنوان ناقل عمل نموده، هنگامی که از سطح بدن پرندگان حساس جوان تغذیه می‌کنند، لکوسیتوزئون را به آنها انتقال می‌دهند. پرندگانی که از این بیماری جان سالم به در می‌برند، دوباره حامل بیماری می‌شوند.

نشانه‌های بالینی

شروع بیماری معمولأ به صورت ناگهانی می‌باشد و در مدت کوتاهی تعداد زیادی از پرندگان نشانه‌های بیماری را بروز می‌دهند. کسالت، بی اشتهایی، تشنگی، از دست دادن تعادل، ضعف و کم خونی وجود دارد. ممکن است تنفس پرنده سریع و مشکل باشد. دوره بیماری اغلب کوتاه است و پرندگان مبتلا در عرض چند روز یا می‌میرند یا بهبود می‌یابند. میزان مرگ و میر متغیر ولی اغلب بالا می‌باشد.

جراحات

۱- در پرندگانی که چند روزی زنده می‌مانند ممکن است بزرگ شدن کبد و طحال و شواهدی از کم خونی وجود داشته باشد. بزرگ شدن طحال مشخص ترین ضایعه این بیماری می‌باشد.

۲- در زیر میکروسکوپ، درمغز تعدادی از پرندگان که عدم تعادل داشته‌اند، شیزونت‌های بزرگ (مگالوشیزونت‌ها) دیده می‌شود. شیزونت‌های کوچک انگل غالبأ در کبد مشاهده می‌گردند.

تشخیص

با بررسی گسترش خونی پرنده مبتلا، بعد از رنگ آمیزی آن به روش گیمسا یا رایت، این بیماری را می‌توان تشخیص داد. بعضی از سلولهای خونی حاوی گامت‌های لکوسیتوزئون می‌باشند. معمولأ شکل سلولهای مبتلا به وسیله گامت‌ها تغییر می‌کند واندازه آنها به طور مشخصی افزایش می‌یابد. درمقاطع بافت شناسی کبد و مغز، معمولأ شیزونت‌ها و مگالوشیزونت‌ها مشخص می‌باشند.

۲-۴- واکنش زنجیر‌های پلی مراز( PCR )

کاربرد:

تکنیک PCR کاربرد‌های نامحدودی در عرصه‌های مختلف زیست ملکولی دارد. علت اصلی این امر این است که DNA الگو به کار رفته در PCR را می‌توان از منابع مختلف تامین کرد و مورد استفاده قرار داد.

به طور کلی PCR به دو منظور اصلی به کار برده می‌شود :

۱-تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن

۲-بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA

برخی کاربرد‌ها یا این تکنیک شامل:

- تشخیص عوامل عفونی (ویروس‌ها، باکتری‌ها، انگل‌ها و… )

- تشخیص جهش‌ها (P.N.D و سرطان‌ها و… )

- کلون سازی ژن

- تعیین توالی‌های کروموزومی انسان در سلول‌های هیبریدی( هترو کاریون‌ها )

- تعیین جنسیت جنین

اساس کار

توسعه و انجام PCR یک تجربه در علم بیولوژیکی ملکولی ایجاد می‌کند. به کمک این تکنیک می‌توان ناحیه خاصی از ژن را که بین دو ناحیه شناخته شده DNA است تکثیر نموده تکثیر DNA با بهره گرفتن از پرایمر‌ها و ملکول‌های DNA الگو انجام می‌گیرد که تحت شرایط خاص پرایمر‌ها به DNA الگو متصل شده و با در دسترس بودن عوامل دیگرهمانندسازی DNA، ساخت قطعه‌ای از DNA آغاز می‌گردد. اگر شرایط مهیا باشد می‌توان از یک قطعه DNA در ۳۰ سیکل و در مدت کوتاهی تا ۵/۱ قطعه به دست آورد.

برای انجام PCR دو پرایمر مکمل DNA مورد احتیاج است این دو پرایمر در جهت مخالف با DNA هدف هیبرید می‌شوند DNA بین آن تکثیر می‌یابد. برای سنتز DNA، یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت مورد نیاز است. آنزیم (Taq) پلی مراز که از یک باکتری گرما دوست به نام ترموس اکواتیکوس بدست می‌آید. به عنوان مهم ترین آنزیم مورد استفاده برای PCR محسوب می‌گردد.

۲-۴-۱- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR

- DNA هدف

- PCR Buffer 10X

- آنزیم DNA پلی مراز (Taq DNA Polymerase 5u/ul )

- نوکلئوتید‌ها یا دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP 10Mm)

- کلرورمنیزیم (MgCl2 50Mm )

- پرایمر

- بافر PCR و کمک کننده ها

- آب مقطر

- میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری

- میکروسانتریفیوژ

۲-۴-۲- سنتز

سنتز چند مرحله دارد :

۱-مرحله واسرشت سازی قطعات DNA

در این مرحله حرارت باعث تک رشته‌ای شدن ملکول‌های دو رشته‌ای DNA در حضور آغاز گرها، چهار نوع dNTP¸ بافرPCR و آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت می‌شود. درجه حرارت این مرحله معمولا بین ۹۵-۹۳ درجه سانتی گراد است.

۲-مرحله هم سرشت سازی:

با پایین آوردن درجه حرارت تا حد ۶۵-۳۷ درجه سانتی گراد بسته به TM مورد استفاده موجبات اتصال آغازگرها به DNA تک رشته شده فراهم می‌آید. پرایمرها ۳۰-۱۸ نوکلئوتید می‌باشند و اگر امکان داشته باشد پرایمرها را به گونه‌ای طراحی می‌کنند که TM پرایمر‌ها یکسان باشند.

برای بدست آوردن TMپرایمر هااز فرمول زیر استفاده می‌شود :

(تعداد بازهایC¸G) ×۴+(تعداد بازهایTM=2×(T¸A

درجه حرارت مناسب برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف ۵-۳ درجه سانتی گراد زیر TM می‌باشد چون آنزیم پلی مراز در درجه حرارت‌های مختلف فعال است از همان درجه حرارت لازم برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف به منظور طویل شدن DNA نیز استفاده می‌شود.

۳-بسط آغازگرها :

در این مرحله آنزیم DNA پلی مراز از ۳ انتهای پرایمر همانند سازی می‌کند. این آنزیم در ۷۲ درجه سانتی گراد بین ۴۵ تا ۱۰۰ نوکلئوتید در ثانیه همانند سازی می‌کند که این میزان بستگی به PH بافر غلظت نمک و DNA هدف دارد. سپس این فرایند حداقل برای ۲۰ سیکل دیگر تکرار می‌شود.

در فرایند PCR¸ درجه حرارت ۹۷-۹۴ درجه سانتی گراد برای جدا شدن دو زنجیره DNA و ۷۵-۵۵ درجه سانتی گراد برای همانند سازی لازم است ولی نهایتا سیکل آخر همانند سازی^[۲۲] ۵ دقیقه طول می‌کشد تا تمامDNA به رشته‌های دو زنجیره‌ای تبدیل شود.

۲-۴-۳- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR:

فراورده‌های PCR عبارت از یک قطعه (یا قطعاتی) از DNA هستند که طول آنها معمولا برابر با ناحیه حد وسط در آغاز گر می‌باشد.

برای تشخیص و تعیین هویت قطعات تکثیر یافته از روش‌های مختلف می‌توان سود برد که این موارد عبارتند از :

الف) ژل الکتروفورز

ب) تشخیص آنی ناحیه تکثیری

ج) تشخیص ایمونولوژیکی فراورده‌های PCR

د) ارزیابی به وسیله جرقه با SPA^[23]

از مجموع موارد فوق تنها به توزیع مختصری در مورد روش ژل الکتروفورز که آسانترین و متداول ترین روش مورد استفاده است می‌پردازیم.

ژل الکتروفورز :

آسانترین، متداول ترین روش مورد استفاده برای تشخیص و تجزیه فراورده PCR الکتروفورز است. الکتروفورز مقداری از فراورده‌های PCR بر روی ژل آگارز یا ژل پلی اکریلامید، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید( یک ماده رنگی که دارای خاصیت فلورسنت است) و آنگاه مشاهده ژل در زیر فرابنفش(uv) یکی از ساده ترین روش‌ها برای تشخیص و بررسی فراورده‌های PCR پس از رنگ آمیزی و با تابش نور uv به ژل مشاهده DNA و ژل، امکان پذیر می‌گردد. حال می‌توان از ژل عکس برداری کرد و نتیجه را ثبت کرد.

مارکر‌های مقیاسی و فراورده‌های PCR مربوط به کنترل آزمایش را می‌توان در چاهک‌های جانبی ژل قرار داد تا امکان تعیین دقیق اندازه قطعات تکثیر شده فراهم آید. مارکر‌های DNA در اندازه‌های مختلف به صورت تجاری قابل تهیه می‌باشند.

فصل سوم

«مواد و روش کار»

۳-۱- نمونه گیری

پس ازهماهنگی با کشتارگاه‌های صنعتی استان اصفهان واقع در شهرستان‌های تیران و کرون و نجف آباد تعداد ۲۰۰ نمونه خون و۲۰۰ نمونه کبد جمع آوری گردید توضیح اینکه از هر گله تعداد ۱۰نمونه خون و ۱۰ نمونه کبد اخذ گردیده است. سپس نمونه‌ها در کنار یخ به آزمایشگاه زنده یاد دکتر فرشاد زمانی دهکردی واقع در دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد. نمونه‌ها تا زمان انجام آزمایش در دمای۲۰- درجه سانتی گراد نگه داری شدند.

۳-۲- استخراج DNA از کبد با بهره گرفتن از کیت

استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNP^TM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.

۱- به ۱۰۰µg از نمونه‌های کبد گرفته شده، مقدار ۱۰۰µl بافرپرتئاز و ۵µl پرتئاز اضافه شد و به مدت یک ساعت در دمای ۵۵ درجه در Heater قرار داده شد تا آنزیم اثر کند.

۲- مقدار ۲۵۰محلول Lysis اضافه شد و به مدت ۱ دقیقه ورتکس شدید انجام شد.

۳- ۳۰۰µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).

۴- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.

۵- نمونه‌ها به مدت ۸ دقیقه در۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.

۶- ۵۰۰µl از بافرشستشو دهنده (Wash Buffer) به تیوب‌ها افزوده و ۵مرتبه واژگون شد.

۷- نمونه‌ها به مدت ۵دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.

۸- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.

۹- نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.

۱۰- پس از خشک شدن رسوب حاصله در ۵۰µl آب مقطرحل شد.

۱۱- به مدت ۵ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.

۳-۳- استخراج DNA از خون با بهره گرفتن از کیت

استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNP^TM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.

۱- ۲۰۰µlخون بهمراه ۷۰۰µlLysis و به مدت ۱ دقیقه ورتکس شدید انجام شد.

۲- ۵۰۰µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).

۳- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.

۴- نمونه‌ها به مدت ۸ دقیقه در۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.

۵- ۵۰۰µl از بافر شستشو دهنده^[۲۴] به تیوب‌ها افزوده و ۵ مرتبه واژگون شد.

۶- نمونه‌ها به مدت ۵دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.

۷- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.

۸- نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.

۹- پس از خشک شدن رسوب حاصله در ۵۰µl آب مقطرحل شد.

۱۰- به مدت ۵ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.

۳-۴- آزمایش PCR

جهت تکثیر قطعه ژن کد کننده آنتی ژن انگل هیستوموناس مله اگریدیس، از ۲ زوج پرایمر اختصاصی منتشر شده توسط وی لی و همکاران درسال ۲۰۱۱ (۲۲) که با بهره گرفتن از توالی ژنوم شماره ژن بانک AF293056 (33) توسط شرکت سینا ژن سنتز شده است، مورد استفاده قرار گرفته است :

Hmf 5´-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3´(forward)

Hmr5´-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3´(reverse)

۳-۴-۱- روش کار

جهت انجام آزمایش PCR و تکثیر ژن‌های مورد نظر از دستگاهMastercycler Gradiant Eppendorf ¸ Germany)) با حجم نهایی ۲۵ میکرو لیتر شامل: ۱ میکروگرم نمونه DNA و ۱میکرولیتر از هر پرایمر، ۲ میکرولیتر منیزیوم کلراید و ۲۰۰ میکرولیتر از dNTP و ۵/۲ میکرولیتر از بافر ۱۰x و ۱ میکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز بود (Fermentas, Germany). واکنش PCR در شرایط دمایی زیرانجام شد.

برنامه حرارتی مورد استفاده شامل یک سیکل ۹۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه و ۳۸ سیکل تکراری شامل واسرشت سازی در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد در ۳۰ثانیه همسرشت سازی در دمای ۵۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱ دقیقه و گسترش در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد برای ۱ دقیقه و گسترش نهایی در دمای ۷۵ درجه سانتی گراد به مدت۱۰ دقیقه انجام شد.

۳-۵- تهیه ژل آگارز

۳-۵-۱- مواد و وسایل لازم

- پودر آگارز (ساخت شرکت Fermentas آلمان )

- بافر۱X TBE

- بافر بار گذاری^[۲۵]

-اتیدیوم بروماید

-آب مقطر

-سمپلر در حجم های مختلف

-سر سمپلر زرد و آبی

-دستگاه ماکروویو

-ترازوی دیجیتال

-ظروف شیشه ای آزمایشگاهی

- قالب و شانه مخصوص ژل

-تانک الکتروفورز

- منبع تنظیم ولتاژ برق^[۲۶]

-دستگاه تصویر بردار ژل^[۲۷]

۳-۵-۲- روش تهیه بافر (۱X) TBEبرای تهیه ژل آگارز

مقادیر ۹۹/۱۰۸ گرم از پودرTris base، ۶۵/۵۵ گرم ازپودر Buric Acid و ۴۴/۱ گرم از پودر EDTA را با یکدیگر مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ml1000 رسانده تا TBE (10X) ساخته شود. سپس (۱۰X)TBE را به نسبت۱به ۱۰ با آب مقطر مخلوط کرده تا TBE با غلظت ۱X تهیه شود.

۳-۵-۳- روش تهیه ژل آگارز

برای ساخت ژل آگارز ۱% پودر آگارز را به میزان ۳/۰ گرم وزن کرده و با ml30 بافر (۱X) TBE مخلوط کرده و حرارت داده تا پودر آگارز ذوب شود و در بافر TBE کاملاً حل شود و پس از آنکه حرارت محلول حاصل کاهش یافت مقدار ۲ میکرولیتر محلول اتیدیوم بروماید (mg/ml 10) اضافه گردید. سپس محلول حاصل را در قالب مخصوص ژل (Cast) ریخته و شانه ژل (Comb) را جهت تعبیه چاهک داخل ژل قرار داده و اجازه می دهیم تا ژل منعقد شود.

۳-۵-۴- روش انجام الکتروفورز

۱-شانه ژل را از ژل خارج کرده و ظرف ژل را به همراه قالب آن در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(1X) قرار داده به طوری که بافر تمام سطح ژل را بپوشاند.

۲-مقدار ۵ میکرو لیتر از نمونه‌های DNA استخراج شده با ۲ میکرولیتر Buffer 6X مخلوط می‌گردد و درون چاهک‌ها ریخته می‌شود.

۳-تانک الکتروفورز به منبع جریان Power Supply وصل شد و ولتاژ دستگاه روی ۸۰ ولت تنظیم می‌گردد.

۴-پس از حدود ۲۰-۳۰ دقیقه جریان ولتاژ را قطع نموده و ژل را برای بررسی روی دستگاه uvidoc قرار داده و پس از بررسی صحت DNA استخراج شده از آن عکس گرفته شد.

۳-۵-۵- آنالیز محصول PCR:

محصول PCR بر روی ژل ۱ درصدآگارز با ولتاژ ۸۰ ولت برای مدت ۳۰ دقیقه الکترفورز گردید سپس ژل مورد نظر با اتیدیم بروماید رنگ آمیزی و با دستگاه UV doc مشاهده شد.

۳-۶- آزمایشات هیستوپاتولوژی

برای رنگ آمیزی بافت‌ها از روش رنگ آمیزی استاندارد با نام ائوزین هماتوکسیلین استفاده شد.

برای انجام آزمایشات هیستوپاتولوژی، نمونه‌های بافتی که قبلا در فرمالین ۱۰% قرار داده شده بودند جهت تهیه لام به آزمایشگاه ارسال و پس از تهیه لام هیستوپاتولوژی به روش هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی گردید، که در ادامه مختصری درباره این روش رنگ آمیزی توضیح داده خواهد شد.

۳-۶-۱- رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) :

طریقه ساخت رنگ هماتوکسیلین :

مواد مورد نیاز :

۱-پودر هماتوکسیلین: ۵ گرم

۲-الکل اتیلیک: ۵۰ سی سی

۳-پتاسیم آلوم : ۱۰۰ گرم

۴-آب مقطر : ۹۵۰ سی سی

۵-اکسید مرکوریک : ۲/۵ گرم

۶-اسید استیک : ۴ سی سی

رنگ هماتوکسیلین را در ارلن کوچک ریخته و به آن الکل اضافه می‌کنیم. به کمک حرارت روی بخاری یا داخل بن ماری ۵۶ درجه، رنگ را داخل الکل خوب حل می‌کنیم. پودر پتاسیم آلوم را در یک ارلن مناسب ریخته و به آن آب مقطر اضافه می‌کنیم به کمک حرارت و تکان دادن مکرر پودر را داخل آب مقطر حل می‌کنیم، در حالی که این محلول گرم است. محلول الکلی هماتوکسیلین را به آن اضافه می‌کنیم و محتوای ارلن را حرارت داده و مرتب تکان می‌دهیم. هنگامی که محلول جوش آمد، بی درنگ در کم تر از ۱ دقیقه ارلن را از حرارت دور کرده و با احتیاط پودر اکسید مرکوریک را اضافه می‌کنیم، مجددا محلول را حرارت می‌دهیم تا رنگ ارغوانی تیره ظاهر شود. سپس محلول را از حرارت دور کرده میگذاریم تا سرد شود. اسید استیک اضافه می‌کنیم، بعد از آن محلول را صاف می‌کنیم. در این موقع محلول قابل استفاده است ولی بهتر است ۲ تا ۴ هفته رنگ بماند بعد مورد استفاده قرار گیرد.

ساخت رنگ ائوزین

رنگ ائوزین : گرم، الکل خالص : ۱۳۰ سی سی

رنگ ائوزین را در الکل حل کرده، قبل از استفاده به ازای هر ۱۰۰ سی سی محلول رنگ ۵/۰ سی سی اسید استیک اضافه گردد. این محلول رنگ استوک (ذخیره) است که هنگام استفاده باید به نسبت یک حجم رنگ با دو حجم الکل ۸۰ درجه رقیق گردد.

ساخت محلول دیفرانسیانسیون (محلول اسید الکل) :

۱ سی سی اسید کلریدریک به اضافه ۱۰۰ سی سی الکل ۷۰ درجه خوب مخلوط می‌کنیم.

۳-۶-۲- روش رنگ آمیزی اسلاید با رنگ (H&E) :

اسلاید را در زنبیل رنگ آمیزی قرار داده، زنبیل را داخل دستگاه اتو با دمای ۶۰ درجه قرار می‌دهیم. حدود۲۰-۳۰ دقیقه در اتو بماند. با این کار برش به سختی روی سطح لام می‌چسبند. حال زنبیل حاوی اسلاید را به ترتیب در محلول‌های ذیل انتقال می‌دهیم رعایت زمان‌های ذکر شده الزامی است.

۱-بوکال محتوی گزیلول : ۵ دقیقه

۲-گزیلول : ۲ دقیقه

۳-الکل ۱۰۰ درجه : ۲ دقیقه