وبلاگ

برای جلوگیری از رشد قارچ و جلبک، استوک­ها در یخچال و در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند. طی دوره رشد گیاه، برای جلوگیری از ظهور جلبک بر روی پرلیت و محلول غذایی که یکی از مشکلات کشت­های هیدروپونیک است، اطراف ریشه دانه­رست­ها و روی محلول غذایی، نایلون­های مشکی کشیده شد. با بزرگتر شدن گیاه این مشکل از بین می­رود و نیازی به استفاده از این نایلون­ها نیست.

شکل ۲-۲٫ استفاده از نایلون­های مشکی در اطراف ریشه­ گیاه و محلول غذایی برای جلوگیری از رشد جلبک

اعمال تنش خشکی
تنش خشکی توسط پلی اتیلن گلیکول ۶۰۰۰ در غلظت ۲۰% به مدت ۴۸ ساعت اعمال شد.

تیماردهی
پس از ۴۸ ساعت تنش خشکی به مدت ۹ روز تیماردهی به گلدان­ها آغاز شد. به این صورت که به گلدان­های شاهد محلول هوگلند و به سایر گلدان­ها نانوکلات پتاسیم در سه غلظت ۱۵- ۲۵ و ۳۵ ppm به­ صورت محلول دهی داده شد.

نمونه­برداری
اولین نمونه برداری قبل از اعمال تنش خشکی صورت گرفت. پس از اتمام تنش، دومین نمونه­برداری انجام شد. سایر نمونه­برداری­ها پس از تنش در انتهای روزهای سوم، ششم و نهم از هر یک از تیمارها صورت گرفت. برگ­ها به­ صورت تصادفی در فاصله میان ­گره­های دوم و سوم چیده شدند و داخل فویل قرار داده شدند. نمونه­ها پس از فریز شدن داخل ازت مایع، به فریزر ۷۰- منتقل و تا زمان آنالیز نگهداری شدند.
۲-۹ سنجش پرولین
جهت اندازه ­گیری پرولین مطابق روش بتس و همکاران Bates, et al. 1973)) انجام شد. این روش بر اساس تشکیل یک ترکیب رنگی در اثر واکنش میان اسید آمینه پرولین آزاد و معرفی به نام ناین هیدرین (با فرمول C₉H₆O₄ و جرم مولکولی ۱۵/۱۷۸ گرم بر مول) در شرایط اسیدی و دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد و سپس تخلیص این ترکیب رنگی به کمک یک حلال آلی غیر قطبی مانند تولوئن استوار است. در اثر ترکیب پرولین و ناین هیدرین، ماده­ای رنگی به نام دی کتوهیدرین دیلیدین ایجاد می­ شود. شدت رنگ این ترکیب وابسته به مقدار پرولین می­باشد و با اندازه ­گیری جذب نوری می­توان به مقدار پرولین پی برد. در این آزمایش ابتدا ۵/۰ گرم ماده تر گیاهی در ۵ میلی لیتر محلول ۳ درصد سولفوسالیسیلیک اسید ساییده شد. پس از صاف نمودن مخلوط با کاغذ صافی واتمن شماره ۲، ۲ میلی لیتر از آن در لوله آزمایش ریخته و ۲ میلی لیتر معرف اسید نین هیدرین (۲۵/۱گرم نین هیدرین در اسید استیک۲۰درصد) و ۲ میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه گردید. لوله­ها به مدت یک ساعت در بن ماری دمای۱۰۰ درجه قرار گرفتند و سپس به حمام یخ منتقل شدند. آنگاه ۴ میلی لیتر تولوئن به هر لوله اضافه شد و پس از تکان دادن لوله­ها، مدت ۲۰ ثانیه ثابت نگه داشته شدند تا اینکه دو لایه مجزا تشکیل شد. سرانجام جذب لایه فوقانی (حاوی تولوئن و پرولین) در طول موج ۵۲۰ نانومتر خوانده شد و مقدار پرولین با بهره گرفتن از منحنی استاندارد تعیین شد.
منحنی استاندارد با در دست داشتن غلظت­های مختلف پرولین و جذب هر کدام از غلظت­ها رسم و معادله منحنی استاندارد به­دست آمد.
منحنی استاندارد پرولین
۲-۱۰ سنجش پروتئین کل به روش برادفورد
۲-۱۰-۱ تهیه معرف^[۱] برادفورد:
معرف برادفورد شامل۱۰۰میلی گرم پودر کوماسی بریلیانت بلو G-250 ،۵۰ میلی گرم اتانول ۹۶%. ۱۰۰میلی لیتر اسید فسفریک (w/w)85 درصد می باشد. این سه ماده را با هم مخلوط کرده و به حجم ml 200 می­رسانیم. به این ترتیب محلول x5 به­دست می ­آید که باید در ظرف تیره نگهداری شود. در زمان آزمایش، محلول فوق را ۵ بار رقیق می­کنیم تا محلول x1 به­دست آید.
برای تهیه محلول استوک mg/ml1 آلبومین سرم گاوی (BSA)، مقدار معینی (۱میلی گرم) از این پروتئین را در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در زمان استفاده آن را ده برابر رقیق می­کنیم. حال از این غلظت در لوله‏های آزمایش به­ترتیب۰، ۵، ۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵، ۳۰ و ۳۵ و۴۰و ۴۵ ماکرولیتر BSA می­ریزیم و با آب مقطر به حجم ۵۰ می­رسانیم و به هر کدام ml 5/2 محلول برادفورد x1 با رعایت فاصله­ی زمانی ۲ دقیقه اضافه می‏کنیم و به مدت ۲۵-۳۰ ثانیه لوله­ها را ورتکس می­کنیم. بعد از ۱۵ دقیقه جذب لوله­ها در طول موج ۵۹۵ نانومتر با ر عایت همان مقدار فاصله­ی زمانی با اسپکتروفتومتر می­خوانیم. به این ترتیب منحنی استاندارد (جذب علیه (mg/ml)BSA)رسم شده و به کمک آن و با بهره گرفتن از شیب خط منحنی، غلظت پروتئین کل محاسبه شد.
۲-۱۱ سنجش کلروفیل و کاروتنوئید
۵/۰ گرم برگ تر از هر تکرار توزین شده و توسط نیتروژن مایع در داخل هاون چینی آسیاب شد و به آن ۵ میلی­لیتر استون ۸۰ درصد (۲۰ آب مقطر: ۸۰ استون) اضافه گردید. مخلوط به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه با دور (rpm)3000 در دمای ۴ درجه سلسیوس سانتریفیوژ گردید. در نهایت عصاره استونی شفاف جدا شده و حجم آن با استون خالص به ۵ میلی لیتر (حجم اولیه) رسانده شد. سپس شدت جذب محلول در طول موج­های ۴۷۰، ۶۴۶ و ۶۶۳ با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر (CamSpec M501 UV/Visible) در مقابل شاهد قرائت شد. در نهایت برای تعیین مقدار کلروفیل و همچنین کاروتنوئید کل از فرمول­های زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Chl.a= (12.25 A₆₆₃–۲٫۷۹ A₆₄₆) ×V/W
Ch1.b=(21.50 A₆₄₆–۵٫۱ A₆₆₃)×V/W
Chl.T= Chl.a + Chl.b
Car.=(1000 A₄₇₀ – ۱٫۸۲ Chl.a – ۸۵٫۰۲ Chl.b)/198×V/W
که در روابط بالا V حجم استن به میلی لیتر و W وزن تر برگ بر حسب گرم می‌باشد. غلظت کلروفیل و کاروتنوئید کل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ می­باشد.
۲-۱۲ اندازه ­گیری مالون دی آلدهید
برای این منظور ۵/۰ گرم از بافت برگ در هر تکرار با ml5 تری کلرواستیک اسید ۵% ساییده شد. عصاره حاصل، به مدت ۱۵ دقیقه، در دمای اتاق و با دور rpm)) 14000 سانتریفیوژ شده و سپس محلول رویی توسط سمپلر جدا شد. پس از آن به حجم مساوی از محلول رویی (سوپرناتانت) TCA20درصد حاوی۵/۰ درصد TBA افزوده گردید. مخلوط حاصل به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب جوش با دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد قرار داده و بلافاصله درظرف یخ سرد شد؛ سپس ۲۰۰۰ میکرولیتر از سوپرناتانت به میکرتیوپ منتقل و به مدت ۵ دقیقه در دور rpm)) 7500 سانتریفیوژ شد. سپس جذب کمپلکس MDA+TBA در nm 532 قرائت شد. جذب بقیه رنگیزه­های غیراختصاصی در nm 600 تعیین شد و از میزان جذب در nm 532 کسر گردید. برای محاسبه غلظتMDA از ضریب خاموشی mM^-1cm^-1155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول واکنش پراکسیداسیون لیپیدهاست، بر اساس نانو مول در گرم وزن تر محاسبه شد.
۲-۱۳ استخراج آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
به منظور استخراج عصاره آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی مثل فنل از متانول ۸۰% استفاده شد. ابتدا برگ توتون را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۸ درجه سانتی ­گراد در آون قرار داده تا نمونه­ها کاملا خشک شوند. سپس نمونه­ها را در هاون چینی ریخته و به خوبی کوبیده شد تا کاملا خرد شوند. سپس ۵/۰ گرم از هر نمونه آسیاب شده وزن شده و به لوله­های شیشه ­ای دارای برچسب با ذکر مشخصات انتقال داده شد. سپس به لوله­ها ۵ میلی لیتر متانول ۸۰% اضافه و به­آرامی مخلوط شد. نمونه­ها ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه شیک شدند. بعد از سپری شدن این زمان، عصاره­ها با بهره گرفتن از کاغذ صافی واتمن، صاف شده و عصاره­های صاف شده به مدت ده دقیقه در دور (rpm) 1500 سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ، محلول رویی با دقت برداشته شده و به لوله­های شیشه ­ای با ذکر مشخصات انتقال داده شدند. سپس در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی ­گراد برای مراحل بعدی نگهداری شدند.
۲-۱۳-۱ سنجش آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
از بین آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی، سنجش غلظت فنل نمونه­ها با روش رنگ­سنجی و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد.
۲-۱۳-۱-۱ سنجش فنل تام
سنجش مقدار فنل تام با بهره گرفتن از روش Gaoو همکاران انجام شد که نیازمند استفاده از معرف Folin-Ciocalteu و استاندارد گالیک اسید است. برای این منظور ۱۰۰ میکرولیتر عصاره در داخل لوله شیشه ­ای ریخته شد. سپس ۲۰۰ میکرولیتر حلال فولین و ۲۰۰۰ میکرولیتر آب مقطر به آن اضافه شد. پس از گذشت ۳ دقیقه، ۱۰۰۰ میکرولیتر کربنات سدیم ۲۰% در غیاب نور اضافه شد. در نهایت نمونه­ها به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای اتاق گذاشته شدند. بلانک نیز به همین ترتیب با ۱۰۰ میکرولیتر حلال به­جای عصاره آماده شد. بعد از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با بلانک، جذب نمونه­ها در طول موج ۷۶۵ نانومتر خوانده شد.
۲-۱۳-۱-۲ رسم منحنی استاندارد گالیک اسید
جهت به­دست آوردن غلظت فنل تام نمونه، از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده شد. غلظت­های مختلف گالیک اسید شامل: ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر تهیه شد. به این ترتیب که غلظت گالیک اسید ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر را با متانول ۵۰% تهیه کرده و سایر غلظت­ها مطابق جدول (۲-۴) آماده شدند.
جدول ۲-۴