وبلاگ

۱-۲-۶ Real- Time PCR
۱ -۲-۶-۱ تعریف و مفهوم Real- Time PCR
همانطور که از معنی واژه بر می‏آید Real-time PCR مشاهده لحظه به لحظه یک فرایند می‏باشد. مشکلات و نواقص عدیده موجود در end Point PCR همراه با نیاز به یک روش تعیین کمی دقیق زمینه گشایش عرصه‏ای نوین در تکنیک PCR گردید. Real Time PCR یا qRT- PCR روش تغییر یافته‏ای است که برای ارزیابی کمیت نسبی یک رونوشت خاص در تعدادی نمونه و ارزیابی سطح تجمع آن رونوشت پس از تیمارهای مختلف یا در بافت‏های مختلف استفاده نمود. qRT- PCR یک روش بر مبنای PCR است که برای تکثیر و اندازه‏گیری میزان ملکول هدف به صورت همزمان به کار می‏رود، علت نامگذاری این روش Real- Time PCR اندازه‏گیری DNA تکثیر شده بعد از تجمع آن در واکنش، در زمان واقعی است.

در این روش از دو طریق میزان ملکول هدف اندازه‏گیری می‏شود:
استفاده از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی تغییریافته DNA
هیدرولیز کاوشگرها (کاوشگر TaqMan)
هیبریداسیون کاوشگرها (light Cycler)
۱-۲-۶-۲ استفاده از رنگ آمیزی فلورسنت DNA مانند SYBR Green
این رنگ‏آمیزی برای تعیین تنها میزان DNA به کار رفته و با تمام محصولات دو رشته‏ای PCR، اختصاصی و غیر اختصاصی (دایمر پرایمرها) اتصال می‏یابد (گائوچون و همکاران، ۲۰۰۴).
انجام qRT- PCR با بهره گرفتن از ترموسایکلر و میزان فلورسنت با بهره گرفتن از یک دستگاه ردیاب محقق می‏شود. SYBR Green تنها زمانی که به DNA دو رشته‏ای متصل می‏شود، از خود نور فلورسنت ساطع می‏نماید. برای تعیین دقت آزمایش، از یک ژن خانه‏دار (مرجع) برای کنترل مثبت و آب به عنوان کنترل منفی استفاده می‏شود. بدین ترتیب تغییر در کمیت و کیفیت RNA قابل تشخیص می‏شود (نولان و همکاران، ۲۰۰۶).
۱-۲-۶-۳ مزایای روش Real- Time PCR
تکثیر در هر زمان قابل مشاهده می‏باشد. به عبارتی امکان مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش فراهم آمده و در هر سیکل امکان بررسی فرایند تکثیر وجود دارد.
امکان بهینه ‏سازی واکنش به طوری که مناسب‏ترین غلظت DNA و پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر مشخص می‏شود.
امکان قطع واکنش در زمان دلخواه: از آنجائیکه روند PCR قابل مشاهده می‏باشد، در صورت عدم تکثیر و یا رفتن به فاز سکون می‏توان به واکنش خاتمه داد و از اتلاف وقت و انرژی پرهیز نمود.
انجام PCR کمی: با بهره گرفتن از روش کمی‏ کردن مطلق و کمی کردن نسبی، میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه قابل اندازه‏گیری است.
معمولا واکنش‏ها سریع‏تر اتفاق می‏افتد و زمان کمتری لازم است.
محدوده تشخیص آن بالاتر از PCR معمولی است. حتی اختلاف کمتر از ۲ برابر را هم نشان می‏دهد.
۱-۲-۶-۴ روش بررسی کمی بیان ژن یا quantitative real-time PCR
پیدایش Real Time –PCR و Real Time Reverse Transcription PCR یا Real Time RT- PCR بطور قابل توجهی سنجش بیان ژن را متحول نموده است. Real Time –PCR تکنیک جمع‏آوری داده‏های واکنش PCR همزمان با انجام آن بوده و تکثیر و تشخیص را در یک مرحله انجام می‏دهد. این امر بوسیله انواع متنوعی از واکنش‏های شیمیایی مرتبط با نور فلورسنس انجام می‏گیرد که غلظت محصول PCR را به شدت نور فلورسنس تولیدی مرتبط می‏ نمایند (هیگوچی و همکاران، ۱۹۹۳).
فرایند شیمیایی مورد استفاده در سیستم PCR Real- Time امکان تشخیص فراورده‏های PCR را در طی فازهای ابتدایی واکنش ایجاد می‏نماید. این امر دارای مزایای زیادی در مقایسه با روش‏های PCR معمولی است. روش‏های معمولی از ژل‏های آگارز برای شناسایی محصولات PCR در فاز انتهایی یا نقطه نهایی واکنش استفاده می‏ نمایند. روش PCR Real- Time10000تا۱۰۰۰۰۰ بارحساس‏تر از روش‏های RNase protection assey (وانگ، ۲۰۰۵)،۱۰۰۰ بار حساس‏تر از روش dot blot hybridization بوده و حتی قادر به تشخیص تنها یک کپی از یک نسخه‏برداری خاص هستند (جنتل و همکاران، ۲۰۰۱)؛ و دارای ضرایب انحراف کوچکتر (cv برای SYBR Green 2/14%،TaqMan 24%) در مقایسه با روش‏های نقطه پایانی مانند دانسیتومتری باشد (۹/۴۴%) و هیبریدیزاسیون پروب (۱/۴۵%) هستند. Real-Time PCR همچنین قادر است بین RNA های پیامبر (mRNAs) با توالی‏های بسیار نزدیک تفاوت قائل شود. این روش به مقادیر نمونه RNA بسیار کمتری نیاز داشته و در صورت مناسب بودن تجهیزات، مقادیرنسبتا بالایی محصول واکنش تولید می‏نماید. واکنش Real-Time PCR را می‏توان به ۴ فاز اصلی تقسیم نمود: فاز خطی زمین‏های، فاز اولیه نمایی (Exponential Phase)، فاز خطی لگاریتمی (Linear Phase) وفاز کفه (Plateau Phase) (تیچوپد و همکاران، ۲۰۰۳). این مراحل در شکل ۲-۴ نشان داده شده‏اند. طیف از خطی زمینه‏ای (معمولا ۱۵-۱۰ چرخه اول) PCR آغاز شده و انتشار فلورسنس در هر چرخه هنوز از سطح زمینه فراتر نمی‏رود. همانگونه که ذکر گردید فلورسنس پایه (Baseline floresence) در این زمان محاسبه می‏گردد. در فازنمایی اولیه، میزان فلورسنس به سطح آستانه‏ایی ا CT می‏رسد که بطورمعنی‏ داری (معمولا ۱۰ برابر انحراف استاندارد فلورسنس پایه) بالاتر از سطوح زمینه‏ای است. اصطلاح CT مربوط به کمپانی ABI بوده و این معیار نشانگر تعداد نسخه اولیه موجود در نمونه اصلی بوده و از آن برای محاسبه نتایج آزمایش استفاده می‏گردد (هاید و همکاران، ۱۹۹۶).
شکل-۴-۲ منحنی تکثیر فازهای Real –time PCR
۱-۲-۶-۵ آنالیز کمی mRNA با بهره گرفتن از Real-Time PCR
آنالیز کمی mRNA با بهره گرفتن از Real-Time PCR به وسیلهروش سایبرگرین (SYBR®Green) به طور وسیعی در مطالعات بیولوژیک کاربرد پیدا کرده است. اساس روش Real-Time نورسنجی است، بدین صورت که میزان نور فلورسنس که از هر تیوپ ساطع می‏شود، در هر سیکل توسط دستگاه خوانده می‏شود. میزان نور فلورسانت ساطع شده توسط محصولات، نمایانگر میزان نمونه اولیه خواهد بود و با میزان محصولات PCR نسبت مستقیمی دارد. اندازه‏گیری میزان محصول توالی هدف به دو روش انجام می‏پذیرد:۱(اندازه‏گیری مطلق ۲) اندازه‏گیری نسبی.
در اندازه‏گیری مطلق تعداد توالی هدف موجود در یک نمونه مشخص می‏شود که این روش نیازمند یک نمونه استاندارد است تا میزان دقیق تعداد توالی موردنظر در آن مشخص باشد که این می‏تواند پلاسمید ژن موردنظر باشد و در اندازه گیری نسبی، میزان بیان ژن موردنظر را نسبت به ژن‏های ساختاری سلول تحت عنوان ژن‏های خانه‏دار (House keeping genes) بیان می‏کنند. از جمله ژن‏های ساختاری سلول می‏توان به Ubiquitin C، β-Actin و GAPDH اشاره کرد.
فصل دوم
بررسی منابع
گونه‌های اکسیژن واکنشگر در سلول‌های گیاهی دارای منابع تولید زیادی می‌باشند. برخی از آن‌ ها در متابولیسم طبیعی سلول مانند فتوسنتز و تنفس نقش دارند. بر اساس دیدگاه‌های رایج، ROS یک محصول ثانویه اجتناب‌ناپذیر از متابولیسم هوازی است (Asada and takahashi,1987. دیگر منابع ROS متعلق به مسیرهایی هستند که در طی تنش‌های غیرزنده نظیر شوری، خشکی، سرما و… به وجود می‌آیند… گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجادشده، دارای انواع سیستم دفاعی (آنزیمی و غیر آنزیمی) می‌باشند. سیستم دفاعی آنزیمی شامل سوپر اکسید دیسموتاز^[۴] (SOD)، کاتالاز^[۵] (CAT)، آسکوربات پراکسیداز^[۶] (APX) و گلوتاتیون ردوکتاز^[۷] (GR) و سیستم غیر آنزیمی شامل آسکوربات، توکوفرول، کاروتنوئیدها می‌باشند که با به دام انداختن رادیکال‌های آزاد باعث از بین بردن ویا غیرفعال شده آن‌ ها می‌شوند. (بلوخین، ۲۰۰۳)
نتایج بسیاری از تحقیقات نیز نشان می‌دهد که فعالیت این آنزیم‌ها در بافت برگ ارقام حساس و محتمل به خشکی بسیار از گونه‌ها افزایش میابد (بور،۲۰۰۳: دمیرل و ترکن ۲۰۰۵) اگرچه این افزایش فعالیت آنزیم در ارقام محتمل بیشتر از ارقام حساس گزارش‌شده است (شالاتا و همکاران، ۲۰۰۱)
در بررسی که میرزایی همکاران (۲۰۱۳) روی دو گونه از Brassica napus تحت تنش خشکی انجام شد گزارش کردند که با افزایش تنش خشکی افزایش آنزیم‌های سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در بافت برگ و ریشه مشاهده شد؛ اما میزان فعالیت این آنزیم‌ها در گونه SLM046 بیش‌تر از گونه Hyola308 بود. هم‌چنین میزان پر اکسیداسیون لیپیدی نیز در گونه Hyola308 افزایش‌یافته بود. این نتایج نشان داد که تحمل به خشکی در گونه SLM046 بیش‌تر از گونه Hyola 308 است.
میل ترکیبی APX (با مقادیر میکرومولار) و CAT(با مقادیر میلی مولار) با پراکسیداز هیدروژن، نشان‌دهنده این است که این دو در دو کلاس متفاوت از آنزیم‌های حفظ تعادل سلولی قرار دارند. APX  مسئول تعدیل میزان ROS برای سیگنالینگ و CAT مسئول برطرف کردن زیادی ROS در طی تنش است. SOD تقریبا در تمام اجزای سلولی پیداشده است در کلروپلاست ها، سیتوزول، میتوکندری، آپوپلاست. مکان کاتالاز در پراکسی زوم می‌باشند. کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در طی تنش می‌تواند به دلیل رابطه‌ی ضیعت کاتالاز با پیش ماده خود، عاملی در جهت محدود نمودن عمل محافظتی کاتالاز دخالت نموده و باعث غیرفعال شدن کاتالاز گردد.(گرامر، ۲۰۰۲)
در مطالعه‌ای که بای - لی- پینگ و همکاران در سال ۲۰۰۶ در گیاه ذرت انجام دادند مشاهده کردند که تنش خشکی منجر به کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز شده است.
حمید نورانی آزاد در بررسی تنش کم‌آبی در گیاه آفتابگردان گزارش کردند که میزان قندهای محلول، پرولین و هم‌چنین فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز با افزایش تنش کم‌آبی افزایش یافت.
طبق مطالعه فالی و همکاران در سال ۲۰۰۷ در دو رقم کنجد، داراب ۱۴ و یکتا با کاهش میزان رطوبت خاک از ۱۰۰ درصد به ۲۵ درصد ظرفیت زراعی مزرعه میزان فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانت سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز پلی فنیل اکسید از را در برگ و ریشه در هر دو گونه افزایش یافت. اندازه‌گیری میزان مادون دی آلدئید در بافت برگ و ریشه نشان داد که پر اکسیداسیون لیپیدی در یکتا کمتر از داراب ۱۴ بود.
در طی مطالعه‌ای که سعید سیفی زاده و مجید رشیدی در سال ۲۰۱۰ روی عملکرد ریشه و میزان فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدان در چهار ژنوتیب چغندرقند انجام دادند نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی منجر به کاهش عملکرد ریشه شده است. افزایش قابل‌توجهی در فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) برگ‌ها مشاهده شد که تفاوت معنی‌داری بین ژنوتیپ ها ازنظر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و افزایش میزان تنش وجود داشت.
نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که تنش خشکی منجر به تولید گونه‌های اکسیژن فعال که منجر به افزایش نفوذپذیری غشاء، مالون دی آلدئید (MDA) در گیاهان می‌شود. همچنین ارقام با سطوح بالاتری از آنتی اکسیدان­ها مقاومت بالاتر به خشکی نشان دادند.
زهره امینی در بررسی اثر تنش کم‌آبی در مراحل زایشی گیاه جو تحت تیمارهای آبی، دیم و خشکی بر فعالیت آنزیم‌های ضد اکسنده، (POX) و پراکسیداز (CAT) کاتالاز، (APX) آسکوربات پراکسیداز، (SOD) در مراحل مختلف رشد زایشی گیاه جو در شرایط مزرعه بررسی گردید. نتایج نشان داد که با افزایش سن گیاه فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در هر سه تیمار و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان آبی کاهش یافتند. فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان آبی با پیشرفت پیری تغییر معنی‌داری نشان نداد، درصورتی‌که در تیمارهای دیم و خشکی به‌تدریج کاهش پیدا کرد. تنش کم‌آبی در تیمارهای دیم و خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های ضد اکسنده گردید.
عبدالله محمدی و همکاران در بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سه رقم نخود انجام دادند نتایج حاصل از تجزیه‌وتحلیل بیوشیمی نشان داد که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان CAT، GPX و SOD در شرایط تنش با افزایش استرس افزایش یافت.
در مطالعه‌ای که علی‌رضا پور تقی و همکاران در سال ۲۰۱۱ روی آفتابگردان انجام دادن گزارش کردند که گیاهان تحت تنش نسبت به گیاهان شاهد افزایش قابل‌توجهی در فعالیت تمام آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در برگ مانند سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPX)، گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و کاتالاز (CAT) را گزارش کردند.
درطی مطالعه ای که نظری و همکاران در سال ۲۰۰۸ روی بیان نسبی ژن کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در دو ژنوتیپ نخود دسى و کابلى تحت تنش سرما انجام دادندگزارش کردند ، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در رقم دسی افزایش و در رقم کابلی کاهش یافت. میزان بیان ژن آسکوربات پراکسیداز در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت. این افزایش نشان داد که این آنزیم می تواند در تنش سرما پاسخ دهد و کمبود کاتالاز در رقم کابلی را جبران کند. پاسخ به دماى سازگارى و تنش سرما مى تواند در زمان کوتاهى پس از قرارگیرى در شرایط تنش آغاز شده و این زمان کوتاه سازگارى مى تواند برخى از گیاهان نخود را جهت تحمل به تنش هاى شدیدتر آماده سازد.
در بررسی تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن کاتالاز و ارتباط آن با میزان پراکسید هیدروژن در گیاه گندم توسط چلینا (۲۰۰۴) انجام شد مشخص کرد که تجمع پراکسید هیدروژن با کاهش محتوای نسبی آب برگ ارتباط مستقیم داشته و با کاهش محتوای نسبی آب برگ میزان تولید پراکسید هیدروژن افزایش می یابد و با افزایش میزان پراکسید هیدروژن میزان بیان ژن کاتالاز افزایش یافته که به دنبال آن فعالیت آنزیم کاتالاز دو برابر می شود. مقررات پیچیده ای از الگوهای بیان شده از بیان ژن کاتالاز در سطح ترجمه در شرایط شب و روز وجود دارد که اجازه می دهد تا کنترل دقیق میزان پراکسید هیدروژن در برگ صورت گیرد.
مطالعه ای توسط لیکسین و همکاران در سال ۲۰۱۱ روی دو رقم مقاوم و حساس کنتاکی بلوگراس در پاسخ به تنش خشکی انجام شد هدف این مطالعه بررسی پاسخ های آنزیم آنتی اکسیدان به تنش خشکی بود.مطالعات نشان می دهد که زمانی که میزان محتوای نسبی آب به ۲۶ تا ۲۸ درصد رسید افزایش فعالیت آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز در رقم حساس افزایش یافته که در مهار گونه های اکسیژن فعال از طریق تغییرات در سطح بیان ژن مشاهده شد.نتایج نشان میدهد افزایش میزان بیان در رقم حساس بیشتر از رقم مقاوم مشاهده شد و نتایج فعالیت آنزیم نشام می دهد که آنزیم های دخیل در چرخه آسکوربات پراکسیداز نقش مهمی در حفاظت آنتی اکسیدانی در برابر آسیب خشکسالی دارند.
در مطالعه ای که انسل و همکاران در سال ۲۰۱۱ دربررسی بیان ژن و فعالیت آنزیمی تحت تنش خشکی در گیاه برگ لوبیا چشم بلبلی انجام شد گزارش کردند که گونه های اکسیژن فعال در گیاهان اغلب در زمانی که گیاه در معرض تنش های غیر زنده قرار می گیرند تولید می شوند دو آنزیم پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز نقش کلیدی در مهار گونه های اکسیژن فعال دارند .آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز بر روی واکنش های اکسیداسیون و احیا نقش دارند .نتایج نشان داد که در شرایط تنش خشکی میزان بیان ژن گلوتاتیون ردوکتاز در بافت برگ افزایش یافته و میزان افزایش رابطه مستقیمی با شدت تنش دارد.
در بررسی های داکوستا و همکاران در سال ۲۰۰۷ روی تغییرات درفعالیت آنزیم آنتی اکسیدان و پراکسیداسیون لیپیدی روی سه گونه ازگیاه بنت گراس تحت تنش خشکی انجام شد مشاهدات حاکی از آن بود که در هر سه گونه کاهش عمومی در فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانت و افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی گزارش شد تنش خشکی طولانی مدت باعث آسیب اکسیداتیو در هر سه گونه شد گونه بنت گراس مخملی بیش ترین توانایی را در مهار اکسیداتیو را دارا می باشد.
در مطالعه ای که لونا و همکاران در سال ۲۰۰۶ روی تجمع پراکسید هیدروژن و فعالیت و بیان ژن کاتالاز درگندم انجام دادند به این نتیجه رسیدند که تجمع پراکسید هیدروژن ناشی از خشکسالی با کاهش محتوای آب خاک و جذب کربن دی اکسید در ارتباط است.فعالیت آنزیم کاتالاز تحت شرایط تنش خشکی شدید دوبرابرشد.
فصل سوم
مواد و روش­ها
۳-۱ تهیه مواد گیاهی