وبلاگ

۳منو پتاسیم فسفات )gr)۱۰نشاسته۵۰آب شهر (ml)تا رسیدن به ml 1000آب مقطرpH~0/7

۳-۱-۴-کشت باکتری تولید کننده آلفا آمیلاز و تشخیص کیفی تولید آنزیم خارج سلولی
در شروع چند استوک از باکتری باسیلوس لیکنیفورمیس سویه BR1390 به خاطر امتحان اندازه آلفا آمیلاز تولیدی روی محیط کشت جامد شامل نشاسته به مدت ۴۸ ساعت رشد داده شدن. بعد از محلول لوگل جهت رنگ­آمیزی نمونه­ها و مقایسه اندازه فعالیت استفاده شد. بعد به خاطر تعیین بهترین محیط واسه تولید آنزیم نمونه­های دارای فعالیت مناسب به وسیله لوپ استریل به ارلن مایر ۱۰۰ میلی لیتری شامل ۲۵ میلی لیتر محیط پیش کشت و بعد با ۱ درصد تلقیح به چهار محیط کشت تولید MA، MB، MC و MD منتقل گردید. نمونه­ها در شیکر انکوباتور با دمای ۳۰ درجه سانتیگراد و حرکت دورانیrpm 180 رشد داده شد. ۲۴ ساعت پس از تلقیح، تولید آنزیم به وسیله نشاسته ۱/۰% القا شد.
هم اینکه به خاطر نگهداری باکتری در کوتاه مدت (واسه چند ماه) یه کلنی از باکتری در شرایط سترون در محیط مایع کشت داده شد و سلول­ها پس از سانتریفیوژ در مخلوط مساوی از محیط کشت و گلیسرول ۵۰% استریل قرار گرفت و در فریزر ۲۰- نگهداری شد. نمونه­ها واسه نگهداری دراز مدت در فریزر ۸۰- درجه سانتی گراد منتقل گردید.
۳-۲- بررسی سینتیک رشد و فعالیت آلفا آمیلازی باکتری در محیط کشت پایه
به خاطر بررسی سرعت رشد، باکتری در محیط کشت پایه رشد داده شد و در ادامه اندازه تراکم نوری^[۶۲] (OD) در طول موج ۶۰۰ نانومتر درزمان ۳۴ ساعت اندازه گیری شد. هم اینکه اندازه فعالیت آنزیمی اونم در ساعت­های جور واجور پس از القا مورد امتحان قرار­گرفت.
۳-۳- روش­های استفاده شده در مراحل امتحان و تخلیص آلفا آمیلاز
۳-۳-۱- تخلیص آنزیم آلفا آمیلاز
در این تحقیق اول محیط کشت شامل باکتری به مدت ۱۰ دقیقه با دور g5000 سانتریفوژ گردید و بعد محلول رویی که شامل آلفا آمیلاز بود در دمای ˚C 4، با ۵۰ درصد (v/v) استن سرد رسوب­دهی گردید. بدین صورت که استن به آرومی به محلول رویی که به­وسیله­ مگنت روی استیرر در حال هم­زدن بود، اضافه گشت و پس از نیم ساعت رسوب به وسیله فیلتر از محلول جدا و به دلیل نداشتن فعالیت آنزیمی دور ریخته شد و محلول رویی به وسیله استن۷۰ درصد (v/v) رسوب دهی دوباره گردید. بعد در دمای ^˚C4 در g 5000 محلول پروتئینی به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ انجام شد و رسوب حاصل در دست کم حجم بافرB حل گردید. نمونه در دمای ˚C 4 در بافر B دیالیز شد و پس از دو بار تعویض بافر به فاصله­ی ۱۳ و ۵ ساعت (طول کل مدت دیالیز ۲۲ ساعت بود) به عنوان محلول آنزیمی مورد امتحان آنزیمی قرار گرفت.
۳-۳-۲- تخلیص روی ستون DEAE-Cellulose
واسه جفت و جور ستون تعویض آنیونی DEAE-Cellulose، از ستونی با قطر ۵/۲ سانتی متر و طول ۱۰ سانتیمتر رزین استفاده شد. پس از آماده سازی ستون و به تعادل رسوندن اون با بافر B، محلول شامل آنزیم روی ستون منتقل گردید و بعد ستون با همون بافر شستشو داده شد تا همه پروتئین­هایی که به ستون تعویض یونی وصل نشده­ان، خارج شن. پس از اینکه جذب ۲۸۰ نانومتر نمونه­های خارج شده از ستون به صفر رسید با به کار گیری ایجاد یه گرادیان خطی ۵/۰-۰ مولار سدیم کلراید برابر ۱۲ حجم ستون در بافر مشابه، پروتئین­های وصل شده به رزین برحسب اندازه بار منفی سطحی و قدرت اتصالشان به رزین به ترتیب با افزایش قدرت یونی بافر شستشو از ستون جدا شده و در لوله­های جور واجور جمع­بیاری شد. با در نظر گرفتن اینکه پس از چند بار انجام تخلیص به وسیله ستون DEAE-cellulose مشاهده شد که آنزیم مورد نظر قبل از شیب غلظت از ستون خارج می شه، در دفعات بعد پس از صفر شدن جذب nm 280 ستون با نمک یه مولار شسته شد. با اندازه ­گیری غلظت پروتئینی نمونه­ها به وسیله جذب ۲۸۰ نانومتر و هم اینکه تعیین اندازه فعالیت آمیلازی هر کدوم از فراکسیون­های دارای جذب پروتئینی، آنزیم آلفا آمیلاز مورد نظر جدا گردید. در این تحقیق نمونه­ها در لوله­های ۳ میلی لیتری با سرعت عبور ml/min 1 جمع­بیاری گردید. هم اینکه نمونه­های پروتئینی پس از تغلیظ به وسیله غشای UF با Cut off برابر kDa 10 در فریزر با دمای ۲۰- درجه سانتیگراد قرار گرفت.
۳-۳-۳- امتحان فعالیت آنزیمی
در این تحقیق به خاطر تعیین فعالیت آنزیمی از امتحان با معرف ۳، ۵- دی نیتروسالسیلیک اسید ^[۶۳] (DNS) استفاده شد و فعالیت آنزیمی آلفا آمیلاز با اندازه ­گیری آزاد شدن واحدهای مالتوز و یا گلوکز به عنوان گروه ­های زنده کننده سنجیده شد.
محلول­های مورد استفاده عبارتند از:
محلول ۵/۰% نشاسته
۵/۰گرم نشاسته قابل حل به ml100 بافر A اضافه گردید و روی استیرر قرار گرفت تا نشاسته به آرومی حل شه. محلول حاصل پس از سرد شدن استفاده شد.
محلول ۳، ۵- دی نیتروسالسیلیک اسید(DNS) :
اول gr1 DNS در ۵۰ میلی لیتر آب حل شد و به آرومی gr30 سدیم-پتاسیم تارتارات به اون اضافه گردید. بعد با افزودن۲۰ میلی لیتر محلول NaOH 2 مولار رنگ محلول از زرد به نارنجی شفاف تغییر یافت. در آخر حجم پایانی به ۱۰۰ میلی لیتر رسونده شد. این محلول تا دو هفته قابل استفاده بود.
بافر A
محلول آنزیمی
۳-۳-۳-۱-روش امتحان فعالیت آنزیم
میزانµl 100 نمونه آنزیمی با غلظت مناسب با µl400 سوبسترای مورد نظر مخلوط و در دمای مشخص به مدت نیم ساعت انکوبه گردید. بعد به هر نمونه µl500 محلول DNS اضافه و محلول حاصل به مدت ۵ دقیقه در حموم آب جوش قرار گرفت. پس از خنک شدن، جذب اون در طول موج nm 540 امتحان گردید. فرق جذب نسبت به نمونه تماشاگر به عنوان فعالیت آنزیمی شناخته می­شه که در این رابطه نمونه تماشاگر شامل آنزیم، سوبسترا و محلول DNS در لحظه صفر می­باشه.
۳-۳-۳-۲-واحد آنزیمی
به خاطر محاسبه فعالیت آنزیمی طبق واحد آنزیمی(unit) منحنی استاندارد رسم گردید. اول غلظت­های متفاوت و متوالی از ۰ تا یه میکرومولار D-مالتوز در ۱۰ غلظت جفت و جور شد. به ml 5/0 محلول­های فوق ml 5/0 DNS اضافه و به مدت ۵ دقیقه جوشونده و جذب نمونه­ها در طول موج nm 540 خونده شد. پس از ثبت جذب این غلظت­ها، نمودار استاندارد جذب علیه µmolاز D- مالتوز رسم شد و به کمک اون واحد آنزیمی محاسبه گردید. یه واحد از فعالیت آمیلازی برابره با مقدار آنزیمی که می­تونه یه میکرومول D- مالتوز تو یه دقیقه در شرایط مناسب آزاد کنه (نمودار ۳-۱).
نمودار ۳-۱) منحنی استاندارد غلظت­های جور واجور D-مالتوز در طول موج nm 540
۳-۳-۴- امتحان پروتئین
در این تحقیق واسه امتحان مقدار پروتئین از راه برادفورد^[۶۴] با به کار گیری محلول پروتئینی آلبومین سرم گاوی^[۶۵] (BSA) به عنوان استاندارد استفاده شد. هم اینکه طی تخلیص آنزیم به وسیله ستون کروماتوگرافی DEAE-Cellulose، اندازه پروتئین با بررسی جذب نمونه­ها درطول موج nm280 تخمین زده شد.
۳-۳-۴-۱- امتحان کمی پروتئین به روش برادفورد
در این روش که بر مبنای رنگ­پذیری مولکول پروتئین به وسیله رنگ کوماسی بلو G-250 می­باشه، جذب محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در ۵۹۵ نانومتر خونده شد که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازه ­گیری شده در این طول موج، متغیر بود. واسه تعیین غلظت کمّی پروتئین­ها، اول µl 100 از غلظت­های جور واجور BSA µg/ml) 20، ۴۰، ۶۰، ۸۰ و ۱۰۰) جفت و جور شد و به عنوان استاندارد استفاده شد. بعد از نمونه­های شامل پروتئین مورد امتحان هم به حجم پایانی µl 100، رقت­هایی جفت و جور شد و یه میلی لیتر از معرف برادفورد به یدونه یدونه نمونه­ها اضافه گردید. پس از ورتکس کردن نمونه­های مورد امتحان، جذب اون­ها در ۵۹۵ نانومتر خونده شد. براساس منحنی استاندارد بدست اومده از غلظت­های جور واجور BSA، غلظت پروتئینی نمونه­ها تعیین شد.