وبلاگ

 

۱۳۰ روزگی

چهارگانه ND+AI+EDS+Coryza،
آنفلوانزا،
دوگانه کشته Reo+ IBD

 

 

۲-۲-آزمایش ELISA ^[۱۰]
آزمایش الایزا روش ساده ای برای بررسی تعداد زیاد نمونه در مدت زمان کوتاه می باشد. اساس این آزمایش مشابه سایر آزمایش ها است، بدین معنی که سرم را از لحاظ حضور آنتی بادی اختصاصی بر علیه بیماری‌ها بررسی می‌کند. در این روش عامل بیماریزای نشان دار شده با یک ماده رنگی با نمونه سرمی مخلوط می شود . زمانیکه آنتی بادی به عامل بیماری‌زا متصل میشود ماده رنگی تغییر رنگ می دهد، هر چقدر رنگ تولید شده تیره تر باشد نشان دهنده تیتر بالای آنتی بادی در سرم است .

نتایج این تست ها بصورت تیتر متوسط هندسی GMT^[11] و درصد CV گزارش می شود که اگر درصد CV، حاصله کمتر از ۴۰ باشد، تیتر بدست آمده عالی و اگر بین ۶۰-۴۰ % باشد تیتر خوب و بیشتر از۶۰ % باشد تیتر حاصله ضعیف بوده و نیاز به بهبود دارد. در صورتیکه درصد CV کمتر از ۶۰% باشد، از معیار Mean برای تفسیر نمونه ها استفاده می کنیم. ولی اگر درصد CV بالای ۶۰ درصد باشد از معیار GMT برای تفسیر بهره می گیریم. در مورد اکثر بیماریهای طیور %CV پس از تجویز صحیح واکسن‌های کشته بایستی کمتر از ۴۰% باشد و در مورد واکسن‌های زنده، %CV بایستی کمتر از ۶۰% باشد. در مورد استفاده از واکسن‌های زنده برای واکسیناسیون ابتدایی تغییر تیتر سرمی بسیار مهمتر از %CV می باشد.
GMT، معیاری است که تعداد پرنده ها با یک تیتر خاص و نیز تک تک پرنده ها را مدنظر می گیرد این کار باعث می شود که اثر گذاری پرنده هایی که تیتر خیلی پایین و یا خیلی بالایی دارد از بین برود و به نظر می رسد که این طرز گزارش صحیح‌تر از گزارش بصورت میانگین باشد.
روش کار آزمایش الایزا بدین صورت است که ۲-۳ ساعت قبل از کار باید کیت الایزای مربوطه را ازیخچال درآورده و در محیط اتاق قرار دهیم و بعد استفاده کنیم. در ابتدا سرم نمونه ها را که جدا کرده بودیم در یک پلیت ۹۶ خانه ته صاف جهت رقیق سازی ۱میلی لیتر از رقیق کننده را به پلیت اضافه می کنیم و سپس ۲ میکرولیتر از سرم مورد آزمایش را به پلیت رقت سازی اضافه می کنیم تا رقت ۱:۵۰۰ تهیه شود، لازم بذکر است که کنترلها رقیق سازی نمی شود. سپس ۱/۰ میلی لیتر از کنترل منفی را به گوده های A1 و A2 می افزائیم و ۱/۰ میلی لیتر از کنترل مثبت را نیز به گوده های A3 و A4 اضافه می‌کنیم. در مرحله بعدی ۱۰۰ میکرولیتر از سرم رقت سازی شده مورد آزمایش به پلیت اضافه می کنیم. سپس بمدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه نموده و بعد از آن هر گوده را با ۳۵۰ میکرولیتر ۳ تا ۵ بار با آب دیونیزه شده شستشو می‌دهیم و سپس کاملاً آسپیره می‌کنیم. سپس ۱۰۰ میکرولیتر کونژوگه به هر یک از گوده ها اضافه می کنیم و ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه نموده و مجدداً هر گوده را با ۳۵۰ میکرولیتر آب دیونیزه ۳ تا ۵ بار شستشو می‌دهیم. بعد از این مرحله ۱۰۰ میکرولیتر سوبسترای TMB به هر گوده اضافه می‌کنیم و ۱۵دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم و سپس ۱۰۰میکرولیتر محلول stop را به هر گوده اضافه می‌کنیم و بعداً گوده‌ها را در دستگاه Reader الایزا گذاشته و در نهایت نتایج میزان جذب نوری در طول موجب nm 650 با بهره گرفتن از نرم افزار XChek قرائت نموده، و اطلاعات مربوطه را توسط دستگاه ثبت کرده و این اطلاعات که از ۳ گروه در مراحل مختلف خونگیری بود را ثبت و بایگانی نمودیم.
۲-۳-آزمایش HI^[12]
بسیاری از ویروس‌ها‌ی انسانی و حیوانی قادر هستنند با چسبیدن به گیرنده‌هایی که روی گلبول‌های قرمز وجود دارند ، موجب آگلوتیناسیون آن‌ ها شوند. این حالت اساس آزمایشات HI و HA را تشکیل می‌دهد.
بعضی از ویروس‌های طیور مانند نیوکاسل‌، آنفلوانزا، برونشیت عفونی (بعد از قرار گرفتن در مقابل آنزیم)، گروه ۳ آدنوویروس‌ها و همچنین مایکوپلاسماها قادر هستند گلبول‌های قرمز را جمع نمایند.
آزمایش HI یک روش سرولوژیکی مطمئن و کم هزینه است که به وسیله آن می‌توان سطح آنتی‌بادی را در خون به دنبال عفونت یا واکسیناسیون تعیین نمود. آزمایش HI را می‌توان به دو روش آلفا و بتا انجام داد.
اما روش بتا به خاطر ارزیابی بهتر آنتی‌‌بادی بیشتر در آزمایشگاه‌ها متداول می‌باشد. در این روش رقت‌های سریال از سرم با مقدار ثابت آنتی‌ژن مخلوط می‌شوند. مقدار آنتی‌ژن لازم در آزمایش HI نسبت به نوع ویروس متفاوت می‌باشد. برای نیوکاسل۱۰-۸ واحد ، برونشیت عفونی و آنفلوانزا ۴ واحد و برای مایکوپلاسما ۴-۲ واحد HI تعیین شده
است.
۲-۳-۱- مراحل انجام آزمایش HI
جهت انجام آزمایش HI ، در ابتدا در تمامی گوده ها ،Lµ۲۵ سرم فیزیولوژی ریخته و سپس با بهره گرفتن از سرم مورد نظر که حاوی آنتی بادی می باشد رقت های متوالی را تهیه می‌نمائیم. سپس آنتی‌ژن کالیبره شده را به میزان Lµ۲۵ به تمامی گوده‌ها اضافه کرده و میکروپلیت‌ها را به مدت ۳۰ دقیقه در تاریک‌خانه انکوبه می‌کنیم پس از آن میکروپلیت‌ها را خارج کرده و Lµ۲۵ گلبول قرمز شسته شده را به تمامی گوده‌ها اضافه می‌نمائیم و به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه دیگر نیز انکوبه نموده و نتایج را قرائت می‌کنیم.
مواد و لوازم لازم جهت آزمایش HI

 

 

• سرم فیزیولوژی

 

 

 

• سرم های مثبت ، من
  فی و تحت آزمایش

 

 

 

• سوسپانسیونی از ویروس که در Lµ۵۰ آن ۸ واحد HI موجود است.

 

 

 

• گلوبول قرمز شسته شده ۱ درصد

 

 

 

• میکرو پلیت

 

 

 

• سمپلر

 

 

الف- طرز تهیه گلوبول قرمز شسته شده
برای اطمینان بایستی از مخلوط خون حداقل سه قطعه جوجه استفاده گردد . اما ناچاراً در صورت استفاده از جوجه‌های مایه‌کوبی شده، خون اخذ شده باید دقیقاً شسته شود. خون را با سرنگ استریل از ورید بال یا قلب گرفته و در یک شیشه در دار به نسبت ۴ قسمت خون همراه با یک قسمت سیترات دو سود ۴% و یا با نسبت مساوی با محلول Alsever برای جلوگیری از انعقاد می‌ریزیم و با ملایمت مخلوط می‌نمائیم.
مخلوط خون با ماده ضد انعقاد را با دور RPM1200 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ نموده و پلاسما را دور می‌ریزیم. خون ته نشین شده را به نسبت ۱ به ۲۰ با سرم فیزیولوژی مخلوط و مجددا سانتریفیوژ می‌نمائیم.
عمل سانتریفیوژ کلاً سه بار تکرار می‌شود. خون ته نشین شده را به نسبت ۵/۰ تا ۱ درصد را در سرم فیزیولوژی مخلوط نموده و سوسپانسیون حاصل در آزمایش‌های HA و HI مورد استفاده قرار می‌گیرد.
رسوب گلبول قرمز در لوله سانتریفیوژ را می‌توان به نسبت ۱ سی سی گلبول قرمز در ۱۵ سی سی محلول Alsever خارج گردد. باید توجه داشت که خون‌گیری از مرغ‌های بالغ و سالم به عمل آید تا سیستم ایمنی آن‌ ها تکامل یافته باشد و همچنین از مرغ‌های تب‌دار نباید استفاده شود.
ب- آنتی ژن
تهیه آنتی ژن بستگی به نوع عامل بیماری دارد. به عنوان مثال در مورد بیماری نیوکاسل‌، این عمل با تزریق ویروس به تخم‌مرغ جنین‌دار و برداشت مایع آلانتوئیک حاصل می‌شود. معمولا سویه لاسوتا مورد استفاده قرار می‌گیرد. بهتر است ویروس با فرمالین۱/۰ درصد در حرارت ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۶-۲۴ ساعت غیر فعال شود. ویروس غیر فعال شده را می‌توان به مدت ۳-۲ ماه در یخچال ۴ درجه نگه‌داری نمود. میزان آنتی‌ژن مورد نیاز برای آزمون HA نسبت به نوع عامل بیماری متفاوت می‌باشد.
ج- سرم‌های منفی ، مثبت و سرم‌های تحت آزمایش
سرم‌هایی که مورد آزمایش قرار می‌گیرند باید صاف و تمیز باشند. برای رسیدن به این هدف و نیز بدست آوردن سرم کافی موارد زیر توصیه می شود:

 

 

• لوله‌های مورد مصرف از جنس سیلیکون باشند.

 

 

 

• حجم خون بیش از نصف حجم لوله نباشد.

 

 

 

• بعد از بستن در لوله ها ، آنها را تقریبا باید به صورت افقی قرار داد.

 

 

 

• عمل خونگیری در محیط نسبتا گرم صورت می گیرد.