۱-۵ گندزدایی سطحی ریزنمونه ها
با توجه به نمودار۱-۴، مطلوب ترین تیمارها برای گندزدایی بذور گیاه گل بنفشه رقمL. Viola odorata، تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود. بذرهای گیاهی به طور طبیعی با آلودگی همراه میباشند. کاربرد ترکیبات ضدعفونی کننده مانند الکل اتیلیک و هیپوکلریت سدیم موجب کاهش آلودگیهای سطحی ریزنمونه می شود ولی تاثیر چندانی بر عوامل آلوده کننده داخلی اندام گیاهان ندارند (دانشور، ۱۹۹۲). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) برای ضدعفونی اولیه ریزنمونه های دمبرگ ابتدا به مدت ۱۰-۵ دقیقه ریزنمونه ها را با مایع ضدعفونی کننده (پریل ۵%v/v) پیش تیمار شدند و سپس دو تا سه مرتبه با آب جاری شستشو دادند. برای ضد عفونی مرحله اصلی از الکل اتیلیک ۷۰ درصد و هیپوکلریت سدیم استفاده شد. کاربرد الکل اتیلیک بین۳۰ ثانیه تا ۶۰ ثانیه در کاهش آلودگی بذرهای گل بنفشه موثر بود. برای ضد عفونی سطحی مواد گیاهی معمولا از الکل اتیلیک ۷۰ درصد استفاده می شود، زیرا الکل اتیلیک ۹۶ درصد باعث دهیدراته شدن بافت گیاهی می شود. الکل اتیلیک تنها بخشی از میکروارگانیسم ها را از بین میبرد و بعد از آن باید یک ضدعفونی کننده دیگر مثل هیپوکلریت سدیم یا کلسیم استفاده شود. الکل اتیلیک لایه کوتیکولی سطح ریزنمونه را در خود حل نموده و موجب جذب بهتر ماده ضدعفونی می شود. هیپوکلریت سدیم در واکنش با آب، کلر آزاد می کند که موجب بهم زدن ساختار سلولی میکروارگانیسمها می شود. (اثنی عشری و زکایی خسروشاهی، ۱۳۸۸). نعیم و همکاران (۲۰۱۳) برای ضد عفونی ریزنمونههای گیاهی برگ، ساقه و دمبرگ گیاه گل بنفشه رقم Viola odorata از الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱ دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۸ تا ۱۰ دقیقه استفاده کردند. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) ریزنمونههای دمبرگ گیاه Viola patrinii را به مدت ۲ تا ۳ دقیقه در الکل اتیلیک ۸۰ درصد فرو بردند و برای شستشوی سطحی از کلرید جیوه ( (HgCl21/0 درصد ۲ الی ۳ دقیقه استفاده کردند.
نتایج اثر نوع تیمار گند زدایی نشان داد که کمترین درصد آلودگی (صفر درصد) در تیمارهای سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵ دقیقه ) مشاهده شد و بیشترین درصد آلودگی (۴۰ درصد) مربوط به تیمار اول (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۳دقیقه) بود (نمودار۱-۴). آتسوشی و همکاران (۲۰۰۲) گزارش دادند که برگهای نابالغ Viola odorata را با الکل اتیلیک ۷۰% به مدت یک دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۱ درصد به مدت ۱۵ دقیقه برای گندزدایی ریزنمونهها استفاده کردند.
۲-۵ جوانه زنی بذر
در بررسی غلظت های مختلف MS بر درصد جوانه زنی بذرها، آنالیز داده ها نشان داد که در غلظت ۱۰/۱ محیط کشت MS، بهترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۸۸ درصد اتفاق افتاد درصورتی که در محیط کشت MS کامل، کمترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۳۷ درصد مشاهده شد (نمودار ۲-۴). طبق این نتایج مشخص شد که با کاهش غلظت عناصر محیط کشت MS، رشد و جوانه زنی بذرها بهتر شد. همچنین مشاهده شد که به احتمال زیاد به دلیل بالارفتن غلظت عناصر محیط کشت و افزایش بیش اندازه نمک، پتانسیل آب کاهش یافته و دریافت آب و مواد غذایی توسط بذر دچار مشکل گردیده که در نهایت درصد جوانه زنی پائین آمده است. از طرف دیگر، به دلیل اینکه بذرهای گل بنفشه دارای خفتگی طولانی هستند، این پائین بودن غلظت عناصر می تواند به عنوان عامل تحریک جوانهزنی بذرهای گل بنفشه باشد. جیان و من (۲۰۰۶) نیز برای جوانه زنی بذرهای گیاه Viola wittrockiana از محیط کشت MS با غلظت پائین استفاده کردند. آن ها در محیط کشت MS، ۴/۱ غلظت بذرها را رشد دادند.
در بررسی درصد جوانه زنی بذرهای گل بنفشه مشخص شد که بیشترین درصد جوانه زنی (۶۰درصد) در تیمار MS 1/10 قدرت همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر جیبرلین مشاهده شد (نمودار۳-۴). بذرهای بنفشه دارای خفتگی طولانی است بنابرین جوانهزنی آنها کند است (زاهور و همکاران، ۲۰۱۲). جیبرلین از جمله تنظیم کننده های رشد است که در شکستن دوره خواب بذر نقش دارد. غلضت بالای جیبرلین در بذر، خواب بذر را شکسته و جوانه زنی آن را آسان میکند (پیریک،۱۹۷۶). تحقیقات نشان داده است که تنظیم کننده های رشد مثل جبرلین، به تنهایی یا در ترکیب با کاینتین باعث افزایش درصد جوانه زنی Viola odorata شدند (کانت لیف[۲۵]، ۱۹۹۱و کارپنتر و بوچر۲،۱۹۹۱). بهات و همکاران۳ (۲۰۰۵) نشان دادند که گیاه مریم کوهیSwertia angustifoli از خانواده Gentianaceae با کاربرد جبرلین، جوانه زنی آن را تا ۹۶ درصد افزایش داد و کاهش میانگین طول دوره جوانه زنی را به دنبال داشت. در این آزمایش مشخص شد که جیبرلین در جوانهزنی بذور تاثیر مثبت داشت که با نتایج بدست آمده همخوانی داشت.
دربررسی اثر شرایط نوری بر درصد جوانه زنی گیاه گل بنفشه دیده شد که بیشترین درصد جوانه زنی بذرها مربوط به تیمار تاریکی با ۵/۵۲ درصد بود (نمودار۴-۴). بعضی از بذرها برای جوانه زنی نیاز به تاریکی دارند که این در بذر کاهو و چند دسته دیگر از گیاهان مشاهده شده است. بنفشه نیز از جمله گیاهانی است که برای جوانه زنی بهتر باید در معرض تاریکی باشد که نتایج حاصله نشان دهنده این نکته میباشد (حکمتی، ۱۳۸۲).
۳-۵ تولید کالوس
در بررسی تولید کالوس از ریزنمونه های برگ، دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد NAA به همراه BAP، مقدار بسیار کمی کالوس همراه با ریشههای فراوان تولید کردند و یا هیچ گونه کالوس تشکیل نگردید. برای تشکیل کالوس یک نسبت معین از اکسین به سایتوکنین مثلا ۱۰ به ۱ نیاز میباشد و حفظ این تعادل در القاء و تشکیل کالوس حائز اهمیت است (دانشور، ۱۹۹۲). هورمون NAA از جمله اکسینهای قوی است. احتمالا به علت قوی بودن این هورمون و به هم خوردن تعادل نسبت اکسین به سایتوکنین، و بالا رفتن بیش اندازه غلظت اکسین در محیط کشت، القاء کالوس زیاد موفقیت آمیز نبود. جیان و من (۲۰۰۶) بیان کردند که کالوسهای گیاه بنفشه بعد از تشکیل خیلی سریع ریشه میدهند. از آنجایی که هورمونNAA از جمله هورمونهای موثر در ریشه زایی است، همان مقدار کالوس تشکیل شده اولیه، بلافاصله شروع به تولید ریشه کرده و روند کالوس زایی متوقف میشود. همچنین در نتیجه ای که توسط کومار و کانوار [۲۶] (۲۰۰۶) در همین زمینه انجام شده است. آن ها مشاهده کردند که کالوسهای برگ گیاه ژربرا درمحیط کشت دارای NAA ریشه دار شدند. همچنین گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند در غلضتهای بالای NAA و BAP هیچ پاسخی در برابر تشکیل کالوس مشاهده نکردند. این آزمایش با آزمایش اسوات و چادهاری[۲۷] (۲۰۰۲) مطابقت نداشت، آنها بیشترین کالوس را از برگهای ژربرا در محیط کشت MS همراه با هورمونهای NAA و BAP بدست آوردند.
در بررسی القاءکالوس گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد ۲,۴-D به همراه BAP، بیشترین وزن کالوس (۵۴/۰ گرم) در محیط کشت MS حاوی ۱ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D تولید شد. و بعد از آن در محیط کشت MS همراه با ۲ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیترBPA بیشترین وزن کالوس (۴۵/۰ گرم) حاصل گردید (نمودار۵-۴). نتایج نشان دادند که با کاهش میزان ۲,۴-D میزان تشکیل کالوس کاهش یافت. همچنین مشاهده شد در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد، کالوس تشکیل نشد. این نتایج نشان داد که در تشکیل کالوس وجود اکسین ضروری است و در محیطهای کشت بدون اکسین، کالوس تشکیل نمی شود. این نتایج با نتایج آتاک و سلیک[۲۸] (۲۰۰۹) مطابت داشت. آنها به تولید کالوس از برگهای ژربرا با بهره گرفتن از ترکیب هورمون ۲,۴-D وBAP دست یافتند. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که اکسین برای بالا بردن القاء کالوس لازم است و هورمون ۲,۴-D اثری بیشتری در تشکیل کالوس نسبت به IBA داشت. آنها در محیط کشت MS با ۵/۰ میکرومول در لیتر ۲,۴-D + 9/8 میکرومول در لیتر BAPبه ۱۰۰ درصد تشکیل کالوس رسیدند و عنوان کردند که غلضت بالای BAP اثر بازدارنده بر تشکیل کالوس دارد.
در بررسی نتایج نوع ریزنمونه بر وزن کالوس تشکیل شده از گیاه گل بنفشه مشاهده شد، نوع ریزنمونه در نتایج تولید کالوس موثر است و بیشترین وزن کالوس (۴۶/۰ گرم) از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد. (نمودار۶-۴ الف). نتایج این آزمایش با نتایج آزمایش گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) مطلابقت داشت. آنها بیشترین وزن کالوس تولید شده را از ریزنمونه دمبرگ Viola patrinii دریافت کردند. همچنین نتایج نشان داد، کمترین میزان تشکیل کالوس از ریزنمونه برگ حاصل شد. جیان و من (۲۰۰۶) هر چند که تفاوت معنی داری در میزان کالوس حاصل از ریزنمونههای برگ و دمبرگ Viola wittrockiana مشاهده نکردند ولی گزارش دادند که کالوسهای حاصل از برگ قهوه ای و کم حجم بودند که تولید ریشه میکردند و از نظر کیفی نسبت به کالوسهای دمبرگ ضعیفتر بودند.
نتایج اثر برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت القاء کالوس نشان داد که بیشترین میزان کالوس (۷۶/۰ گرم) در محیط کشت MS همراه با ۲ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیترBPA از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار۶-۴ب). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) بیشترین وزن کالوس تولیدی را از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشتMS همراه با ۴۴/۱۳ میکرومول در لیتر NAA + 33/13 میکرومول در لیتر BA بدست آوردند. نعیم و همکاران گزارش دادند که نتایج القاء کالوس در ریزنمونههای برگ، دمبرگ و ساقه Viola odorata متفاوت بود.
۴-۵ باززایی از کالوس
یکی از عوامل مهم برای ایجاد یک باززایی موثر و موفقیت آمیز، تشکیل و تولید کالوس باکیفیت به مقدار مناسب است. کالوسهای حاصل از ریزنمونههای دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه در مرحله اول کشت دارای کیفیت و انسجام ساختاری ضعیفی میباشند که باید برای رشد بیشتر و کیفیت بهتر زیر کشت شوند. شرایط لازم برای رشد کالوس (محیط رشد، عوامل فیزیکی موثر در رشد) معمولا مشابه با شرایط لازم برای القای تشکیل کالوس میباشد، با این تفاوت که غلضت اکسین و سیتوکنین کمتر است (پیریک،۱۹۷۶). به همین دلیل کالوسهای حاصل از اولین مرحله کشت، به محیط کشتهای جدید زیرکشت شدند. این عمل زیر کشت ۲ بار انجام گرفت. محیطهای کشت جدید حاوی ۲۵/۰ میلی گرم در لیتر IBA بودند. نتایج نشان داد که کالوسهای تولیدی بعد از زیر کشت شدن، دارای توانایی باززایی بالاتری نسبت به کالوسهای زیر کشت نشده بودند. زانگ و همکاران [۲۹](۱۹۹۳) و فانگ و همکاران۲ (۲۰۰۰) به این نتیجه پی بردند که زیرکشت دوم روی کالوس برای باززایی موفقیت آمیز خواهد بود. همچنین نجیب و همکاران (۲۰۰۹) عنوان داشتند که زیرکشت کردن برای توسعه کالوس ها و باززایی شاخساره لازم است. جیان و من (۲۰۰۶) در باززایی بنفشه از کالوس گرفته شده از دمبرگ متوجه شدند که زیر کشت، برای باززایی شاخساره خیلی اهمیت دارد. آنها با مقایسه کالوسهایی که زیرکشت شدند بودند و کالوسهایی که بدون زیر کشت به محیط باززایی منتقل شده بودند، مشاهده کرند کالوسهای زیر کشت نشده، بعد از انتقال به محیط کشت باززایی، ریشه دادند و باززایی شاخساره موفقیت آمیز نبود. نتایج مشابهی در بعضی از گونههای گیاهی توسط اسریکاندراج و همکاران[۳۰]، ۱۹۸۲و گاریران و همکاران۲، ۱۹۹۹ گزارش شده است.
۱-۴-۵ آزمایش اول باززایی
نتایج اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین تعداد شاخساره (۹۴/۲ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم TDZ به دست آمد (نمودار ۸-۴). TDZ نسبت به سایرسایتوکنینهایی که استفاده شد خیلی قویتر عمل می کند (ناگنت و واردلی ریچاردسون،۱۹۹۱۳). ساجید و فهیم۴ در سال ۲۰۰۹ نشان دادند که وقتی TDZ در مقدار کم به محیط کشت اضافه شود خیلی موثرتر است. شاید به همین دلیل است که مقدار ۱ میلیگرم در لیتر TDZ بهتر از مقدار ۲ میلیگرم در لیتر TDZ در تشکیل شاخساره موثر بوده است. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که در محیط کشت MS همراه با ۵/۴ میکرومول در لیتر TDZ و ۰۲/۰ ( (w/vزغال فعال، بالاترین درصد باززایی (۹/۲۱ ٪) را به دست آوردند. در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر Kin+ 5/0 میلیگرم در لیتر BAP و محیط کشت MS همراه با ۱میلیگرم در لیتر + Kin 5/0 میلیگرم در لیتر BAP کمترین تعداد شاخساره (۱ عدد) مشاهده شد (نمودار۸-۴).
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بیشترین تعداد شاخساره (۴ عدد) با انتقال کالوسهای تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۵/۰ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیترBAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلیگرم در لیتر TDZ به دست آمد و بعد از آن بیشترین تعداد شاخساره (۸/۳ عدد) با انتقال کالوسهای تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۲ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلیگرم در لیترTDZ بود (جدول ۶-۴). نتایج نشان داد که محیطهای کشت تولید کالوس همراه با اکسین و سایتوکنین، باززایی بهتری نسبت به سایر تیمارها نشان دادند. سایتوکنینها وقتیکه توام با یک اکسین استفاده شوند، باعث تحریک تقسم سلولی میشوند (آماسیون[۳۱]، ۲۰۰۵).
درمورد اثر نوع محیط کشت تولید کالوس برشاخص طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد که بیشترین طول شاخساره (۲/۴ سانتی متر) در محیط کشت MS حاوی ۱میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP به دست آمد (نمودار۹-۴ الف). با توجه به نتایج بدست آمده مشخص شد در محیطهای کشت تولید کالوس حاوی اکسین توفوردی و BAP، طول شاخساره بیشتربود. جیان و من (۲۰۰۶) گزارش کردند، BAP روی طویل شدن شاخسارههای حاصل از باززایی موثر بود.
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین طول شاخساره (۸۲/۶ سانتی متر) با انتقال کالوس حاصل از محیط کشت MS همراه با ۱ میلیگرم در لیتر۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱ میلیگرم در لیتر TDZ به دست آمد (جدول ۷-۴ ). این نتایج نشان داد که محیطهای کشت تولید کالوس که علاوه بر اکسین توفوردی حاوی BAP بودند، با انتقال به محیط کشت باززایی، طول شاخساره بیشتری، تولید کردند. احتمالا افزودن سیتوکنین در مرحله تولید کالوس، باعث تجمع سایتوکنین درونی سلولهای تمایز نیافته کالوس می شود که موجب میگردد، کالوس در مرحله باززایی و تولید شاخساره بهتر عمل کند.
۲-۴-۵ آزمایش دوم باززایی
بیشترین تعداد و همچنین طولانی شدن طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه از ریزنمونه دمبرگ تولیدگردید (۱۰-۴ الف). این نتایج با نتایج ساتو و همکاران (۱۹۹۵) مطابقت داشت. آنها از کالوسهای گرفته شده از دمبرگ ویولای وحشی، باززایی شاخساره انجام دادند. اورلیکوکا و همکاران[۳۲] (۱۹۹۹) عنوان داشتند که بخشی از شاخه زایی به نوع ریزنمونه ای که کالوس از آن حاصل میشود بستگی دارد. آنها به باززایی ۶ شاخساره از هر قطعه کالوس حاصل از دمبرگ ژربرا دست یافتند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین تعداد شاخساره (۲۳/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیترBAP به دست آمد (نمودار ۱۰-۴ ب). نتایج نشان داد که در محیطهای کشت حاوی BAP، تعداد شاخساره بیشتر از سایر محیطهای کشتی بود که فقط حاوی اکسین بودند. وجود سایتوکنین در محیط کشت بر روی شاخه زایی اثر مثبت داشت. این نتایج با نتایج نجیب و همکاران (۲۰۰۹) مطابقت داشت. آن ها مشاهده کردند که افزودن BAP و توفوردی به محیط کشت موراشیک و اسکوگ، روی تولید کالوس و باززایی گیاه موثر است.
نتایج بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بیشترین تعداد شاخساره (۹۶/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلیگرم در لیتر NAA تولید شد. بعد از آن تیمار محیط کشت ۱ میلی گرم در لیترTDZ دارای بیشترین تعداد شاخساره بود (۵۶/۴ عدد) (نمودار۱۰-۴ ج). طبق این نتایج مشاهده شد که در محیطهای کشت حاوی TDZ، باززایی با نسبت خوبی انجام گرفت و در محیطهای بدون TDZ، باززایی با نسبت پائینی اتفاق افتاد که کمترین میزان باززایی در محیط کشت MS همراه با ۵/۰میلیگرم در لیتر Kin + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP(58/1 عدد) صورت گرفت. (نمودار۱۰-۴ ج). این نتایج با نتایج وانگ و من[۳۳] (۲۰۰۶) مطابقت داشتند. آنها گزارش دادند موفقیت در شاخه زایی و هم چنین، طول و تعداد آن به وجود TDZ همراه با سایر هورمونها بستگی دارد. هاتمن و پرس۳ (۱۹۹۳) عنوان کردند تیدارزرون با تحریک سیتوکنینهای درون زا گیاه، موجب تحریک و شاخهزایی در گیاه میگردد. همچنین نتایج این آزمایش نشان داد که کاربرد اکسین NAAدر کنار TDZ تاثیر خوبی در باززایی شاخساره داشت. هازبولا و همکاران[۳۴] (۲۰۰۸) گزارش دادند که افزودن اکسین، در کنار سایتوکنینها برای القای شاخساره در ژربرا لازم است.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت تولید کالوس برتعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونههای دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد، بیشترین تعداد شاخساره (۷۱/۴ عدد) از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشت MS به همراه ۵/۰ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP تولید شد و کمترین تعداد شاخساره (۷۲/۱) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D بدونBAP اتفاق افتاد (نمودار۱۰-۴ د). زاهور و همکاران (۲۰۱۲) با محیط کشت MS همراه با ۱۵ میکرومولار BAP و ۱۵ میکرومولار Kin به بهترین نتیجه تعداد شاخساره را نشان دادند. آنها مشاهده کردند که با افزایش غلظت BAP از ۵ میکرومولار به ۱۵ میکرومولار، تعداد شاخساره به طور معنیداری افزایش یافت.
نتایج اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۱ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلیگرم در لیتر BAPبه دست آمد. همچنین مشاهده شد، کمترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D بدون BAP صورت گرفت (نمودار ۱۱-۴ ب). این نتایج نشان داد که در محیطهای کشت حاوی BAP، طول شاخساره نسبت به سایر محیطهای کشت بیشتر بود. دانشور (۱۹۹۲) و لاکشمی سیت۳ (۱۹۹۳) اثر مثبت کاربرد سیتوکنینها بر شاخه زایی در گیاهان مختلف را تائید کردند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بلندترین شاخساره (۲۳/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلی گرم در لیتر NAA تولید شد (نمودار ۱۱-۴ ج). این نتایج نشان داد که TDZ تاثیر خوبی بر طول شاخساره داشت. در محیطهای دارای TDZ طول شاخساره نسبت به سایر محیطها بیشتر بود به طوریکه کمترین طول شاخساره در محیط کشت بدون TDZ اتفاق افتاد. محیط کشت MS همراه با۱ میلیگرم در لیتر Kin + 5/0 میلیگرم در لیتر BAP کمترین طول شاخساره ( ۴۶/۱ سانتیمتر) داشت. سونی و کور[۳۵] (۲۰۱۳) گزارش دادند حضور ۵/۰ میلیگرم در لیتر TDZ در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر BAP و ۵/۰ میلیگرم در لیتر جیبرلین، تاثیر خوبی در تشکیل شاخساره از جوانههای Viola pilosa داشت.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت باززایی برطول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونههای دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نیز مشاهده شد، بیشترین طول شاخساره (۵۹/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیترTDZ + 1/0 میلیگرم در لیتر NAA بود که از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار ۱۲-۴ ). در این نتایج مشاهده شد که ترکیب TDZو NAA افزایش معنیداری در شاخه زایی از کالوسهای دمبرگ داشت که این با نتایج ناگنت و واردلی ریچاردسون ( ۱۹۹۱) مطابقت داشت. پیریک و همکاران (۱۹۷۳) گزارش دادند که افزودن یک اکسین قوی مانند NAA به محیط کشت باززایی، در تشکیل شاخساره خیلی موثر است.گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) از کالوسهای حاصل از دمبرگ ویولای وحشی شاخسارههای ۷-۶ سانتی تولید کردند.
نتایج برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونههای دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بلندترین طول شاخساره با انتقال کالوس از محیط کشت MS همراه با ۱ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D به محیط کشت باززایی همراه با ۵/۰ میلیگرم در لیتر + TDZ1/0 میلیگرم در لیتر NAA بدست آمد (جدول ۱۰-۴).
۵-۵ ترکیب بهترین تیمار باززایی همراه با پوتریسین
پلی آمین ها به عنوان تنظیم کننده های رشد گیاهی در محدوده وسیعی از فرایندهای رشد و نمو، شامل تقسیم سلولی، رویان زایی و ریخت زایی مشارکت دارند (کائور-ساهنی و همکاران[۳۶]،۲۰۰۳). پوترسین و پلی آمینهای اسپرمیدین و اسپرمین ممکن است در تقیسم سلولی و رشد و نمو گیاه نقش داشته باشند (باگنی۳، ۱۹۸۶، ِاوَنس و مامبرگ[۳۷]، ۱۹۹۱، گالستون۲، ۱۹۸۳). در این آزمایش اثر پوترسین برباززایی گیاه گل بنفشه بررسی شد. اثر پوترسین بر شاخساره نشان داد، بیشترین طول شاخساره (۱۴/۶ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم بر لیترTDZ + 100میلی گرم در لیتر پوتریسین مشاهده شد که با سایر تیمارها از لحاظ آماری اختلاف معنیداری داشت (نمودار۱۴-۴). این نتایج با نتایج تیروونگدام و همکاران۳ (۲۰۱۲) مطابقت داشت. آنها وجود پلی آمینها در محیط کشت باززایی را موثر دانستند. بسای و متا۴ (۱۹۸۵) نیز نقش پلی آمینها در باززایی شاخساره از برگهای Passiflora sp. را تائید کردند. همچنین در این آزمایش بیشترین تعداد شاخساره در غلضت ۱۰۰ میلیگرم در لیتر پوتریسین به همراه ۱ میلیگرم در لیتر TDZ مشاهده شد که البته این با سایر غلضتهای پوتریسین تفاوت معنی داری نداشت. (نمودار۱۳-۴).
۶-۵ ریشه زایی
در بررسی بین پنج محیط کشت ریشه زایی، بیشترین تعداد ریشه و طول ریشه در محیط کشت MS همراه با ۱ میلیگرم در لیتر NAA + 1/0 میلیگرم در لیترIBA تولید شد و کمترین تعداد ریشه در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد مشاهده شد (نمودار۱۵-۴ و نمودار ۱۶-۴). نتایج نشان داد که ترکیب هورمون NAA با IBA نتیجه بهتری در تعداد ریشه و طول ریشه داشت تا زمانی که از هورمون NAA به تنهایی استفاده شد. همچنین مشاهده شد که با افزایش غلضت هورمون NAA، تعداد ریشه بیشتری تولید شد. پیریک و همکاران (۱۹۸۴) نشان دادند که NAA سبب تسریع در ریشه دهی گیاهچهها در گیاهان خانواده آناناس می شود. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند که گیاهچههای بنفشه وحشی Viola patrinii)) با محیط کشت MS همراه با IAA و IBA دارای رشد و تعداد ریشههای متوسطی (۶۳ درصد) تولید شد. آنها در محیطهای کشت حاوی فقط IAA با غلظت ۷۱/۵ و ۴۲/۱۱ میکرومول در لیتر، تشکیل ریشه قابل توجهی را مشاهده نکردند.
۷-۵ سازگاری
از بین سه نوع بستر کشت، گیاهان رشد یافته در بستر کوکوپیت و پرلیت (۱:۱) بیشترین درصد زندمانی را نشان دادند. همچنین در بستر ترکیبی کوکوپیت و پرلیت گیاهکها، شاخسارههای بلندتری تولید کردند (نمودار ۱۷-۴ و نمودار ۱۸-۴). نتایج نشان داد که مخلوط کوکوپیت و پرلیت، تاثیر مثبتی نسبت به بسترهای جداگانه آنها داشت. پرلیت به دلیل تخلل خوب و زهکشی و تهویه مناسب و کوکوپیت به دلیل اینکه ظرفیت نگه داری آب بیشتری دارد. در مجموع محیط مناسبی را برای رشد گیاهان در شرایط کشت بافت بوجود آوردند. پرلایت دارای طبیعت متخلخل است که به آن توان نگهداشتن مقداری آب می دهد و اندازه ذرات آن تهویه و زهکشی خوبی فراهم می کند. از اثرات مفید کوکوپیت این است که به دلیل داشتن اندازه کوچک ذرات، قدرت نگه داری آب بیشتری دارد ولی حالت غرقاب در گیاه ایجاد نمی کند زیرا خاصیت موئینگی در این ماده بالاست و بستر به تدریج آب خود را از دست می دهد (نوگرا و همکاران[۳۸]، ۲۰۰۰). رشد و نمو گیاه به طور موثری با دسترس بودن فسفر در ارتباط است چون فسفر باعث افزایش طول ساقه گل می شود. گیاهان رشد یافته در بستر کشت کوکوپیت و پرلیت به نسبت (۱:۱) و کوکوپیت به علت pH پایین کوکوپیت عناصر ماکرو مخصوص فسفر و پتاسیم را به راحتی جذب می کنند و رشد بهتری نسبت به گیاهان رشد یافته در بستر پرلیت دارند (احمد و همکاران۲،۲۰۱۲).
۸-۵ نتایج کلی
***نتایج کلی آزمایش گندزدایی بذرهای گل بنفشه نشان داد که بهترین تیمارهای ضدعفونی کننده بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود که در هر دو تیمار درصد آلودگی بذرها صفر گزارش شد.
*** نتایج آزمایش درصد جوانه زنی نشان داد که بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata در محیط کشت همراه با جیبرلین جوانهزنی بهتری نسبت به محیط کشت عاری از جیبرلین داشتند. همچنین تیمار تاریکی نسبت به تیمار روشنایی در جوانهزنی بذرها موثرتر بود.
*** در آزمایش القاء کالوس نتایج نشان داد که تنظیمکننده رشد توفوردی نسبت به NAA در القاء و تولید کالوس از ریزنمونههای گیاه گل بنفشه اثر بیشتری داشت و به طور کلی تیمار ۱ میلیگرم در لیتر توفوردی بیشترین میزان کالوس را تولید کرد. همچنین ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونههای برگ و دمبرگ، تولید کالوس بهتری را نشان داد.
***در آزمایش باززایی گیاه گل بنفشه نشان داد که زیرکشت کردن کالوسها یک عامل مهم در باززایی گیاه گل بنفشه است. زیرا میزان و کیفیت کالوس تولیدی در مرحله اول کشت بسیار کم است و باید برای تولید بیشتر و با کیفیتتر، کالوسها زیرکشت شوند. در این آزمایش بهترین باززایی شاخساره در محیط کشت ۱ میلیگرم TDZ مشاهده شد و ریزنمونه دمبرگ، نسبت به ریزنمونه برگ و ساقه، باززایی بهتری را نشان داد. در ترکیب بهترین تیمار مرحله باززایی با پوترسین نیز به طور کلی بهترین باززایی در تیمار ۱۰۰ میلیگرم در لیتر پوترسین همراه با ۱ میلیگرم در لیتر TDZ مشاهده شد.
*** آزمایش ریشه زایی شاخسارههای تولیدی گیاه گل بنفشه نشان داد که ترکیب دو تنظیم کننده رشدNAA و IBA به ترتیب با غلظتهای ۱ و ۱/۰ میلیگرم در لیتر در ریشه زایی شاخسارها، نتیجه بهتری را داشت. همچنین مشاهده شد که با افزایش تنظیم کنندهNAA تا غلظت ۱ میلیگرم در لیتر، میزان ریشه دهی شاخساره ها افزایش یافت.
*** درسازگاری گیاهک های حاصل از ریزنمونه های گل بنفشه نتایج نشان داد، ترکیب دو بستر کشت کوکوپیت و پرلایت درصد زنده مانی بیشتر و طول شاخساره بلندتری را تا کاربرد مجزای هر یک از این بسترها، در پی داشت.
۹-۵ پیشنهادات:
***گیاه گل بنفشه یک گیاه دارویی –زینتی است و کاربرد زیادی در بحث زیباسازی مناظر شهرها دارد و از طرف دیگر در صنعت داروسازی هم از اهمیت زیادی برخوردار است، در حال حاضر، یک سوم داروهای مورد استفاده بشر را داروهای با منشاء گیاهی تشکیل می دهد. از این رو پیشنهاد می شود که آزمایشهای بیشتری در جهت تولید و تکثیر آن در حد انبوه و تجاری از طریق زمینه کشت بافت صورت گیرد تا بدین طریق میزان متابولیتهای ثانویه مانند فلاونوئیدها، آلکالوئید (ویولین)، روغنهای ضروری ( لینولنیک، هیدروکینون دی متیل اتر) و اسید سالیسلیک افزایش یابند.
***از آنجایی که در این تحقیق تنها یک رقم گیاه گل بنفشه جهت باززایی در نظر گرفته شد، پیشنهاد می شود که سایر رقم های این گونه و همچنین سایر گونه های جنس Viola مورد آزمایش قرار گیرند.
*** پیشنهاد می شود سایر تنظیم کننده های رشد اکسین و سیتوکنین در بررسی کالوس زایی و اندامزایی آن مورد آزمایش صورت گیرد.
*** به دلیل زمان کم این پایان نامه، و پرهزینه بودن استخراج، خالص سازی و شناسایی متابولیتهای ثانویه این گیاه پیشنهاد می شود بخش دارویی این گیاه در تحقیقی دیگر مورد بررسی قرار گیرد.
منابع:
منابع:
۱-سیدطباطبایی، ب. ا. و امیدی، م. ۱۳۸۸. کشت بافت و سلول گیاهی. انتشارات دانشگاه تهران. ۳۶۸ص.
۲-ایوانز، دی.، کولمن، جی. او. دی و کرنز، ا. ۲۰۰۷. کشت یاخته گیاهی. مترجمان: محمود خسروشاهی و مهدی بهنامیان. انتشارات دانشگاه تبریز. ۲۷۷ ص.
۳-اثنی عشری، م. و زکائی خسروشاهی، م. ۱۳۸۸. راهنمای جامع کشت بافت گیاهی. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۴۸۵ص.
۴- چاولا، اچ. اس. ۱۳۸۲. اصول بیوتکنولوژی گیاهی. مترجمان: محمد فارسی و جعفر ذوالعلی. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. ۴۹۵ ص.
۵- پیریک، آر. ال. ام. ۱۹۷۶. مبانی کشت بافتهای گیاهی. مترجم: عبدالرضا باقری. انتشارات دانشگاه مشهد. ۴۰۶ص.
۶- پیری، خ. و نظریان فیروزآبادی، ف. ۱۳۸۵. راهنمای کشت بافت گیاهان. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۲۱۴ص.
۷- فرزاد، م. ع. ۱۹۳۱. گیاهان دارویی و معطر ایران. جلد اول. ۲۶۲ ص.
۸- مظفریان، و. ۱۳۷۹. رده بندی گیاهان (مورفولوژیکی-تاکسونومی). جلد اول. انشارات امیرکبیر تهران. ۵۰۱ ص.
۹- مظفریان، و. ۱۳۹۱. شناخت گیاهان دارویی و معطر ایران. ۱۳۵۰ ص.
فرم در حال بارگذاری ...
