وبلاگ

۳-۱- نمونه گیری
پس ازهماهنگی با کشتارگاه‌های صنعتی استان اصفهان واقع در شهرستان‌های تیران و کرون و نجف آباد تعداد ۲۰۰ نمونه خون و۲۰۰ نمونه کبد جمع آوری گردید توضیح اینکه از هر گله تعداد ۱۰نمونه خون و ۱۰ نمونه کبد اخذ گردیده است. سپس نمونه‌ها در کنار یخ به آزمایشگاه زنده یاد دکتر فرشاد زمانی دهکردی واقع در دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد. نمونه‌ها تا زمان انجام آزمایش در دمای۲۰- درجه سانتی گراد نگه داری شدند.
۳-۲- استخراج DNA از کبد با بهره گرفتن از کیت
استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNP^TM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.
۱- به ۱۰۰µg از نمونه‌های کبد گرفته شده، مقدار ۱۰۰µl بافرپرتئاز و ۵µl پرتئاز اضافه شد و به مدت یک ساعت در دمای ۵۵ درجه در Heater قرار داده شد تا آنزیم اثر کند.
۲- مقدار ۲۵۰محلول Lysis اضافه شد و به مدت ۱ دقیقه ورتکس شدید انجام شد.
۳- ۳۰۰µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).
۴- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
۵- نمونه‌ها به مدت ۸ دقیقه در۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.
۶- ۵۰۰µl از بافرشستشو دهنده (Wash Buffer) به تیوب‌ها افزوده و ۵مرتبه واژگون شد.
۷- نمونه‌ها به مدت ۵دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.
۸- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.
۹- نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.
۱۰- پس از خشک شدن رسوب حاصله در ۵۰µl آب مقطرحل شد.
۱۱- به مدت ۵ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.
۳-۳- استخراج DNA از خون با بهره گرفتن از کیت
استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNP^TM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.
۱- ۲۰۰µlخون بهمراه ۷۰۰µlLysis و به مدت ۱ دقیقه ورتکس شدید انجام شد.
۲- ۵۰۰µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).
۳- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
۴- نمونه‌ها به مدت ۸ دقیقه در۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.
۵- ۵۰۰µl از بافر شستشو دهنده^[۲۴] به تیوب‌ها افزوده و ۵ مرتبه واژگون شد.
۶- نمونه‌ها به مدت ۵دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.
۷- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.
۸- نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.
۹- پس از خشک شدن رسوب حاصله در ۵۰µl آب مقطرحل شد.
۱۰- به مدت ۵ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.
۳-۴- آزمایش PCR
جهت تکثیر قطعه ژن کد کننده آنتی ژن انگل هیستوموناس مله اگریدیس، از ۲ زوج پرایمر اختصاصی منتشر شده توسط وی لی و همکاران درسال ۲۰۱۱ (۲۲) که با بهره گرفتن از توالی ژنوم شماره ژن بانک AF293056 (33) توسط شرکت سینا ژن سنتز شده است، مورد استفاده قرار گرفته است :
Hmf 5´-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3´(forward)
Hmr5´-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3´(reverse)
۳-۴-۱- روش کار
جهت انجام آزمایش PCR و تکثیر ژن‌های مورد نظر از دستگاهMastercycler Gradiant Eppendorf ¸ Germany)) با حجم نهایی ۲۵ میکرو لیتر شامل: ۱ میکروگرم نمونه DNA و ۱میکرولیتر از هر پرایمر، ۲ میکرولیتر منیزیوم کلراید و ۲۰۰ میکرولیتر از dNTP و ۵/۲ میکرولیتر از بافر ۱۰x و ۱ میکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز بود (Fermentas, Germany). واکنش PCR در شرایط دمایی زیرانجام شد.
برنامه حرارتی مورد استفاده شامل یک سیکل ۹۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه و ۳۸ سیکل تکراری شامل واسرشت سازی در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد در ۳۰ثانیه همسرشت سازی در دمای ۵۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱ دقیقه و گسترش در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد برای ۱ دقیقه و گسترش نهایی در دمای ۷۵ درجه سانتی گراد به مدت۱۰ دقیقه انجام شد.

۳-۵- تهیه ژل آگارز
۳-۵-۱- مواد و وسایل لازم
- پودر آگارز (ساخت شرکت Fermentas آلمان )
- بافر۱X TBE
- بافر بار گذاری^[۲۵]
-اتیدیوم بروماید
-آب مقطر
-سمپلر در حجم های مختلف
-سر سمپلر زرد و آبی
-دستگاه ماکروویو
-ترازوی دیجیتال
-ظروف شیشه ای آزمایشگاهی
- قالب و شانه مخصوص ژل
-تانک الکتروفورز
- منبع تنظیم ولتاژ برق^[۲۶]
-دستگاه تصویر بردار ژل^[۲۷]
۳-۵-۲- روش تهیه بافر (۱X) TBEبرای تهیه ژل آگارز
مقادیر ۹۹/۱۰۸ گرم از پودرTris base، ۶۵/۵۵ گرم ازپودر Buric Acid و ۴۴/۱ گرم از پودر EDTA را با یکدیگر مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ml1000 رسانده تا TBE (10X) ساخته شود. سپس (۱۰X)TBE را به نسبت۱به ۱۰ با آب مقطر مخلوط کرده تا TBE با غلظت ۱X تهیه شود.