مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس- قسمت ۲۰

۳۰

بافر تریس* با ترایتون ۱۰۰-X

۳۳۰

حجم نهایی

۴۰۰

* غلظت سوبسترای pNPP : 10 میلی مولار
* بافر تریس دارای غلظت ۵۰ میلی مولار بوده و ترایتون ۱۰۰-X با غلظت نهایی ۱% در بافر وجود دارد.

۳-۳-۷- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی
در این بخش از پژوهش مخلوط بافر، سوبسترا و مایع یونی با غلظتهای نهایی مختلفی از مایعات یونی (بین صفر تا ۵/۱ مولار) [C₂MIM][Br]، [C₄MIM][Br]، [C₆MIM][Br]، [C₁₂MIM][Br] ایجاد شد. با افزودن آنزیم لیپاز به مخلوط ایجاد شده، اثر حضور غلظت های مختلف مایع یونی بر فعالیت آنزیم لیپاز بر اساس روش سنجش گفته شده در بخش ۳-۳-۵ مورد بررسی قرار گرفت. در ضمن برای بدست آوردن فعالیت خالص آنزیمی، میزان هیدرولیز pNPP در حضور غلظت های مختلف مایعات یونی از میزان فعالیت بدست آمده کسر شد.

۳-۳-۸- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا
به منظور بررسی میزان پایداری دمایی لیپاز TTL ، ۰۰۵۲/۰ گرم پودر آنزیم لیوفیلیز شده (دارای غلظت پروتئینی معادل mg/ml 307/0) به μl 600 بافر تریس mM 50 اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملایم آنزیم در بافر حل شد. ۴ محلول آنزیمی به همین روش ایجاد شد. محلولهای به دست آمده در دماهای°C 75 ، °C 80 ، °C 82 و °C 85 در لولههای اپندورف ۵/۱ میلی لیتری در دستگاه هات بلاک انکوبه گردید. در زمانهای ۰، ۱۵، ۳۰، ۴۵ و ۶۰ دقیقه مقداری از هر کدام از نمونههای انکوبه شده برداشته و به مدت ۳۰ دقیقه در یخ قرار داده شد. با بررسی فعالیت آنزیم های انکوبه شده در دماها و زمانهای مختلف پایداری دمایی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۳-۹- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف
در این پژوهش به منظور بررسی میزان پایداری لیپاز TTL در مایعات یونی، ۰۰۵۲/۰ گرم پودر آنزیم لیوفیلیز شده (دارای غلظت پروتئینی معادل mg/ml 307/0) به μl 600 محلول آبی مایعات یونی (دارای آنیون برمید)، با غلظت M 1 ، و یا μl 600 از مایعات یونی نامحلول در آب (دارای آنیون هگزافلوروفسفات) اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملایم آنزیم در مایع یونی محلول یا معلق گردید. مخلوطهای به دست آمده در دماهای °C 85 و °C 90 در لولههای اپندورف در دستگاه هات بلاک انکوبه گردید. در زمانهای ۰، ۱۵، ۳۰، ۴۵، ۶۰ و ۹۰ دقیقه مقداری از هر کدام از نمونههای انکوبه شده برداشته و به مدت ۳۰ دقیقه در یخ قرار داده شد. با بررسی فعالیت آنزیم های انکوبه شده در دماها، زمانها و مایعات یونی مختلف میزان اثر مایع یونی بر پایداری دمایی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. فعالیتهای خالص آنزیمی پس از حرارتدهی آنزیم در حضور مایعات یونی، با کسر فعالیتهای به دست آمده از میزان پایه هیدرولیز pNPP توسط هرکدام از مایعات یونی دارای آنیون برمید، به دست آمد. پایداری دمایی یک نمونه کنترل از آنزیم در عدم حضور مایعات یونی (در بافر تریس mM 50) نیز به همین روش مورد بررسی قرار گرفت. لازم به ذکر است که در رابطه با مایعات یونی نامحلول در آب پس از اتمام زمان یخگذاری مخلوط مایع یونی حاوی آنزیم با حجم مساوی از بافر شسته شد و پس از سانتریفوژ ملایم محلول رویی حاوی آنزیم مورد سنجش فعالیت آنزیمی قرار گرفت.
۳-۳-۱۰- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی
اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی پروتئین در حضور و عدم حضور مایعات یونی مختلف، جهت درک بهتر فرایند باز شدن ساختار پروتئین انجام شد. آنزیم TTL خالص با غلظت نهایی μM 1/0 به مایعات یونی اضافه شد. مایعات یونی نامحلول در آب به صورت خالص استفاده شدند. مخلوط آنزیم با مایع یونی پس از ورتکس ملایم به صورت امولسیون در آمده و در لولههای اپندورف درون چاهکهای دستگاه هات بلاک در دمای °C 85 قرار گرفتند. مایعات یونی محلول در آب (دارای آنیون برمید) با غلظت نهایی ۱ مولار (رقیقسازی با بافر تریس ۵۰ میلی مولار) مورد استفاده قرار گرفتند. یک نمونه کنترل از آنزیم در عدم حضور مایعات یونی نیز دمادهی شد و طیف فلورسانس مربوط به آن ثبت گردید. در رابطه با مایعات یونی نامحلول در آب، برای جداسازی پروتئین از فضای مایع یونی، با حفظ غلظت نهایی آنزیم در μM 1/0، شستشو با بافر تریس ۵۰ میلی مولار انجام شد.
نمونههای پروتئینی در nm 295 برانگیخته شدند و طیفهای نشر فلورسانس بین nm 310 تا nm 500 ثبت گردید. شکاف برانگیختگی و نشر فلورسانس هر دو nm 10 تنظیم شدند. پس از گذشت زمانهای دمادهی مورد نظر (۰، ۳۰، ۶۰ دقیقه) نمونهها در یخ سرد شدند تا در صورت برگشتپذیر بودن دناتوراسیون پروتئینها به حالت طبیعی برگردند و سپس طیف فلورسانس آنها مورد بررسی قرار گرفت.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
آنزیم لیپاز مقاوم به دما (TTL) توسط باکتری ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس نوعی آرکئاباکتر گرمادوست ترشح می شود. این باکتری از یک دریاچه آب گرم در آلمان جداسازی شده است. ژن آنزیم TTL توسط رویتر از ژنوم باکتری جداسازی و وارد وکتور بیانی PQE- 80L شد (Royter M., 2006) (شکل ۴-۱). وکتور حاوی ژن TTL هدیهای از طرف گروه تحقیقاتی در TUHH بود که در این پژوهش به درون باکتری E.coli BL21 منتقل شد و بیان آن مورد بررسی قرار گرفت.
شکل ۴-۱- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL.
۴-۱-۱- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
کلنیهای ۱ تا ۶ حاصل از ترانسفورماسیون، ابتدا کشت یک شبه و سپس کشت ۱% تلقیح در محیط LB حاوی آمپیسیلین μg/ml 100 داده شدند. القای بیان پروتئین به کمک IPTG با غلظت mM 1 به مدت ۶ ساعت انجام شد. سلولهای باکتری بیان کننده پروتئین نوترکیب به کمک سانتریفوژ جمعآوری شده و با غلظت ۱۰ برابر در بافر تریس حل شدند. در مرحله بعد ابتدا با فریز و ذوب کردن سلولها و سپس به کمک آنزیم لیزوزیم و استفاده از امواج صوتی، دیواره سلولی و غشای باکتری ها تخریب شدند. سپس پروتئینهای دناتوره شده و قطعات دیواره های سلولی تخریب شده، به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند. عصاره سلولی حاوی آنزیم TTL جمعآوری شد و میزان فعالیت آنزیم موجود در آن مورد بررسی قرار گرفت. جدول ۴-۱ میزان فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در عصارههای سلولی کلنیهای حاصل از ترانسفورماسیون را نشان میدهد. کمترین فعالیت آنزیمی دیده شده مربوط به کلنی شماره ۴ به میزان U/ml 040/0 است و بیشترین فعالیت لیپازی در مورد کلنیهای ۳ و ۶ با مقادیر ۱۰۶/۰ و ۰۹۳/۰ U/ml دیده شد. هر چند با بررسی غلظتهای پروتئینی و محاسبه فعالیت ویژه (Unit/mg Protein) آنزیم موجود در مخلوط پروتئین، مشاهده شد که کلنی ۶ فعالیت ویژه بیشتری نسبت به کلنی ۳ دارد. بنابراین کلنی شماره ۶ به عنوان بهترین کلنی تولید کننده TTL انتخاب شد.
۴-۱-۲- بهینه سازی زمان پس از القا توسط IPTG با غلظت mM 1
جهت بررسی میزان بیان پروتئین در ساعتهای مختلف پس از القا، ۱ میلی لیتر از محیط باکتری در زمانهای مشخص رسوب داده شد و در بافر SDS-PAGE حل شد. سپس μl 30 از هر کدام از نمونههای سلولی به درون چاهکهای SDS-PAGE وارد شد. بیان پروتئین نوترکیب در زمان ۴ ساعت پس از القا کم و پس از ۵ ساعت افزایش نشان داد. در زمان ۶ ساعت بالاترین بیان پروتئین مشاهده شد و پس از گذشت ۲۴ ساعت تغییری در میزان بیان پروتئین نوترکیب دیده نشد. بنابراین زمان ۶ ساعت به عنوان بهترین زمان برداشت سلولها پس از القا انتخاب شد.
جدول ۴-۱- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای ۱ تا ۶ حاصل از ترانسفورماسیون