وبلاگ

۱-۲-۶ Real- Time PCR
۱ -۲-۶-۱ تعریف و مفهوم Real- Time PCR
همانطور که از معنی واژه بر می‏آید Real-time PCR مشاهده لحظه به لحظه یک فرایند می‏باشد. مشکلات و نواقص عدیده موجود در end Point PCR همراه با نیاز به یک روش تعیین کمی دقیق زمینه گشایش عرصه‏ای نوین در تکنیک PCR گردید. Real Time PCR یا qRT- PCR روش تغییر یافته‏ای است که برای ارزیابی کمیت نسبی یک رونوشت خاص در تعدادی نمونه و ارزیابی سطح تجمع آن رونوشت پس از تیمارهای مختلف یا در بافت‏های مختلف استفاده نمود. qRT- PCR یک روش بر مبنای PCR است که برای تکثیر و اندازه‏گیری میزان ملکول هدف به صورت همزمان به کار می‏رود، علت نامگذاری این روش Real- Time PCR اندازه‏گیری DNA تکثیر شده بعد از تجمع آن در واکنش، در زمان واقعی است.

در این روش از دو طریق میزان ملکول هدف اندازه‏گیری می‏شود:
استفاده از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی تغییریافته DNA
هیدرولیز کاوشگرها (کاوشگر TaqMan)
هیبریداسیون کاوشگرها (light Cycler)
۱-۲-۶-۲ استفاده از رنگ آمیزی فلورسنت DNA مانند SYBR Green
این رنگ‏آمیزی برای تعیین تنها میزان DNA به کار رفته و با تمام محصولات دو رشته‏ای PCR، اختصاصی و غیر اختصاصی (دایمر پرایمرها) اتصال می‏یابد (گائوچون و همکاران، ۲۰۰۴).
انجام qRT- PCR با بهره گرفتن از ترموسایکلر و میزان فلورسنت با بهره گرفتن از یک دستگاه ردیاب محقق می‏شود. SYBR Green تنها زمانی که به DNA دو رشته‏ای متصل می‏شود، از خود نور فلورسنت ساطع می‏نماید. برای تعیین دقت آزمایش، از یک ژن خانه‏دار (مرجع) برای کنترل مثبت و آب به عنوان کنترل منفی استفاده می‏شود. بدین ترتیب تغییر در کمیت و کیفیت RNA قابل تشخیص می‏شود (نولان و همکاران، ۲۰۰۶).
۱-۲-۶-۳ مزایای روش Real- Time PCR
تکثیر در هر زمان قابل مشاهده می‏باشد. به عبارتی امکان مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش فراهم آمده و در هر سیکل امکان بررسی فرایند تکثیر وجود دارد.
امکان بهینه ‏سازی واکنش به طوری که مناسب‏ترین غلظت DNA و پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر مشخص می‏شود.
امکان قطع واکنش در زمان دلخواه: از آنجائیکه روند PCR قابل مشاهده می‏باشد، در صورت عدم تکثیر و یا رفتن به فاز سکون می‏توان به واکنش خاتمه داد و از اتلاف وقت و انرژی پرهیز نمود.
انجام PCR کمی: با بهره گرفتن از روش کمی‏ کردن مطلق و کمی کردن نسبی، میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه قابل اندازه‏گیری است.
معمولا واکنش‏ها سریع‏تر اتفاق می‏افتد و زمان کمتری لازم است.
محدوده تشخیص آن بالاتر از PCR معمولی است. حتی اختلاف کمتر از ۲ برابر را هم نشان می‏دهد.
۱-۲-۶-۴ روش بررسی کمی بیان ژن یا quantitative real-time PCR
پیدایش Real Time –PCR و Real Time Reverse Transcription PCR یا Real Time RT- PCR بطور قابل توجهی سنجش بیان ژن را متحول نموده است. Real Time –PCR تکنیک جمع‏آوری داده‏های واکنش PCR همزمان با انجام آن بوده و تکثیر و تشخیص را در یک مرحله انجام می‏دهد. این امر بوسیله انواع متنوعی از واکنش‏های شیمیایی مرتبط با نور فلورسنس انجام می‏گیرد که غلظت محصول PCR را به شدت نور فلورسنس تولیدی مرتبط می‏ نمایند (هیگوچی و همکاران، ۱۹۹۳).
فرایند شیمیایی مورد استفاده در سیستم PCR Real- Time امکان تشخیص فراورده‏های PCR را در طی فازهای ابتدایی واکنش ایجاد می‏نماید. این امر دارای مزایای زیادی در مقایسه با روش‏های PCR معمولی است. روش‏های معمولی از ژل‏های آگارز برای شناسایی محصولات PCR در فاز انتهایی یا نقطه نهایی واکنش استفاده می‏ نمایند. روش PCR Real- Time10000تا۱۰۰۰۰۰ بارحساس‏تر از روش‏های RNase protection assey (وانگ، ۲۰۰۵)،۱۰۰۰ بار حساس‏تر از روش dot blot hybridization بوده و حتی قادر به تشخیص تنها یک کپی از یک نسخه‏برداری خاص هستند (جنتل و همکاران، ۲۰۰۱)؛ و دارای ضرایب انحراف کوچکتر (cv برای SYBR Green 2/14%،TaqMan 24%) در مقایسه با روش‏های نقطه پایانی مانند دانسیتومتری باشد (۹/۴۴%) و هیبریدیزاسیون پروب (۱/۴۵%) هستند. Real-Time PCR همچنین قادر است بین RNA های پیامبر (mRNAs) با توالی‏های بسیار نزدیک تفاوت قائل شود. این روش به مقادیر نمونه RNA بسیار کمتری نیاز داشته و در صورت مناسب بودن تجهیزات، مقادیرنسبتا بالایی محصول واکنش تولید می‏نماید. واکنش Real-Time PCR را می‏توان به ۴ فاز اصلی تقسیم نمود: فاز خطی زمین‏های، فاز اولیه نمایی (Exponential Phase)، فاز خطی لگاریتمی (Linear Phase) وفاز کفه (Plateau Phase) (تیچوپد و همکاران، ۲۰۰۳). این مراحل در شکل ۲-۴ نشان داده شده‏اند. طیف از خطی زمینه‏ای (معمولا ۱۵-۱۰ چرخه اول) PCR آغاز شده و انتشار فلورسنس در هر چرخه هنوز از سطح زمینه فراتر نمی‏رود. همانگونه که ذکر گردید فلورسنس پایه (Baseline floresence) در این زمان محاسبه می‏گردد. در فازنمایی اولیه، میزان فلورسنس به سطح آستانه‏ایی ا CT می‏رسد که بطورمعنی‏ داری (معمولا ۱۰ برابر انحراف استاندارد فلورسنس پایه) بالاتر از سطوح زمینه‏ای است. اصطلاح CT مربوط به کمپانی ABI بوده و این معیار نشانگر تعداد نسخه اولیه موجود در نمونه اصلی بوده و از آن برای محاسبه نتایج آزمایش استفاده می‏گردد (هاید و همکاران، ۱۹۹۶).
شکل-۴-۲ منحنی تکثیر فازهای Real –time PCR
۱-۲-۶-۵ آنالیز کمی mRNA با بهره گرفتن از Real-Time PCR
آنالیز کمی mRNA با بهره گرفتن از Real-Time PCR به وسیلهروش سایبرگرین (SYBR®Green) به طور وسیعی در مطالعات بیولوژیک کاربرد پیدا کرده است. اساس روش Real-Time نورسنجی است، بدین صورت که میزان نور فلورسنس که از هر تیوپ ساطع می‏شود، در هر سیکل توسط دستگاه خوانده می‏شود. میزان نور فلورسانت ساطع شده توسط محصولات، نمایانگر میزان نمونه اولیه خواهد بود و با میزان محصولات PCR نسبت مستقیمی دارد. اندازه‏گیری میزان محصول توالی هدف به دو روش انجام می‏پذیرد:۱(اندازه‏گیری مطلق ۲) اندازه‏گیری نسبی.
در اندازه‏گیری مطلق تعداد توالی هدف موجود در یک نمونه مشخص می‏شود که این روش نیازمند یک نمونه استاندارد است تا میزان دقیق تعداد توالی موردنظر در آن مشخص باشد که این می‏تواند پلاسمید ژن موردنظر باشد و در اندازه گیری نسبی، میزان بیان ژن موردنظر را نسبت به ژن‏های ساختاری سلول تحت عنوان ژن‏های خانه‏دار (House keeping genes) بیان می‏کنند. از جمله ژن‏های ساختاری سلول می‏توان به Ubiquitin C، β-Actin و GAPDH اشاره کرد.
فصل دوم
بررسی منابع
گونه‌های اکسیژن واکنشگر در سلول‌های گیاهی دارای منابع تولید زیادی می‌باشند. برخی از آن‌ ها در متابولیسم طبیعی سلول مانند فتوسنتز و تنفس نقش دارند. بر اساس دیدگاه‌های رایج، ROS یک محصول ثانویه اجتناب‌ناپذیر از متابولیسم هوازی است (Asada and takahashi,1987. دیگر منابع ROS متعلق به مسیرهایی هستند که در طی تنش‌های غیرزنده نظیر شوری، خشکی، سرما و… به وجود می‌آیند… گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجادشده، دارای انواع سیستم دفاعی (آنزیمی و غیر آنزیمی) می‌باشند. سیستم دفاعی آنزیمی شامل سوپر اکسید دیسموتاز^[۴] (SOD)، کاتالاز^[۵] (CAT)، آسکوربات پراکسیداز^[۶] (APX) و گلوتاتیون ردوکتاز^[۷] (GR) و سیستم غیر آنزیمی شامل آسکوربات، توکوفرول، کاروتنوئیدها می‌باشند که با به دام انداختن رادیکال‌های آزاد باعث از بین بردن ویا غیرفعال شده آن‌ ها می‌شوند. (بلوخین، ۲۰۰۳)
نتایج بسیاری از تحقیقات نیز نشان می‌دهد که فعالیت این آنزیم‌ها در بافت برگ ارقام حساس و محتمل به خشکی بسیار از گونه‌ها افزایش میابد (بور،۲۰۰۳: دمیرل و ترکن ۲۰۰۵) اگرچه این افزایش فعالیت آنزیم در ارقام محتمل بیشتر از ارقام حساس گزارش‌شده است (شالاتا و همکاران، ۲۰۰۱)
در بررسی که میرزایی همکاران (۲۰۱۳) روی دو گونه از Brassica napus تحت تنش خشکی انجام شد گزارش کردند که با افزایش تنش خشکی افزایش آنزیم‌های سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در بافت برگ و ریشه مشاهده شد؛ اما میزان فعالیت این آنزیم‌ها در گونه SLM046 بیش‌تر از گونه Hyola308 بود. هم‌چنین میزان پر اکسیداسیون لیپیدی نیز در گونه Hyola308 افزایش‌یافته بود. این نتایج نشان داد که تحمل به خشکی در گونه SLM046 بیش‌تر از گونه Hyola 308 است.
میل ترکیبی APX (با مقادیر میکرومولار) و CAT(با مقادیر میلی مولار) با پراکسیداز هیدروژن، نشان‌دهنده این است که این دو در دو کلاس متفاوت از آنزیم‌های حفظ تعادل سلولی قرار دارند. APX  مسئول تعدیل میزان ROS برای سیگنالینگ و CAT مسئول برطرف کردن زیادی ROS در طی تنش است. SOD تقریبا در تمام اجزای سلولی پیداشده است در کلروپلاست ها، سیتوزول، میتوکندری، آپوپلاست. مکان کاتالاز در پراکسی زوم می‌باشند. کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در طی تنش می‌تواند به دلیل رابطه‌ی ضیعت کاتالاز با پیش ماده خود، عاملی در جهت محدود نمودن عمل محافظتی کاتالاز دخالت نموده و باعث غیرفعال شدن کاتالاز گردد.(گرامر، ۲۰۰۲)
در مطالعه‌ای که بای - لی- پینگ و همکاران در سال ۲۰۰۶ در گیاه ذرت انجام دادند مشاهده کردند که تنش خشکی منجر به کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز شده است.
حمید نورانی آزاد در بررسی تنش کم‌آبی در گیاه آفتابگردان گزارش کردند که میزان قندهای محلول، پرولین و هم‌چنین فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز با افزایش تنش کم‌آبی افزایش یافت.
طبق مطالعه فالی و همکاران در سال ۲۰۰۷ در دو رقم کنجد، داراب ۱۴ و یکتا با کاهش میزان رطوبت خاک از ۱۰۰ درصد به ۲۵ درصد ظرفیت زراعی مزرعه میزان فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانت سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز پلی فنیل اکسید از را در برگ و ریشه در هر دو گونه افزایش یافت. اندازه‌گیری میزان مادون دی آلدئید در بافت برگ و ریشه نشان داد که پر اکسیداسیون لیپیدی در یکتا کمتر از داراب ۱۴ بود.
در طی مطالعه‌ای که سعید سیفی زاده و مجید رشیدی در سال ۲۰۱۰ روی عملکرد ریشه و میزان فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدان در چهار ژنوتیب چغندرقند انجام دادند نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی منجر به کاهش عملکرد ریشه شده است. افزایش قابل‌توجهی در فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) برگ‌ها مشاهده شد که تفاوت معنی‌داری بین ژنوتیپ ها ازنظر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و افزایش میزان تنش وجود داشت.
نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که تنش خشکی منجر به تولید گونه‌های اکسیژن فعال که منجر به افزایش نفوذپذیری غشاء، مالون دی آلدئید (MDA) در گیاهان می‌شود. همچنین ارقام با سطوح بالاتری از آنتی اکسیدان­ها مقاومت بالاتر به خشکی نشان دادند.
زهره امینی در بررسی اثر تنش کم‌آبی در مراحل زایشی گیاه جو تحت تیمارهای آبی، دیم و خشکی بر فعالیت آنزیم‌های ضد اکسنده، (POX) و پراکسیداز (CAT) کاتالاز، (APX) آسکوربات پراکسیداز، (SOD) در مراحل مختلف رشد زایشی گیاه جو در شرایط مزرعه بررسی گردید. نتایج نشان داد که با افزایش سن گیاه فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در هر سه تیمار و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان آبی کاهش یافتند. فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان آبی با پیشرفت پیری تغییر معنی‌داری نشان نداد، درصورتی‌که در تیمارهای دیم و خشکی به‌تدریج کاهش پیدا کرد. تنش کم‌آبی در تیمارهای دیم و خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های ضد اکسنده گردید.
عبدالله محمدی و همکاران در بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سه رقم نخود انجام دادند نتایج حاصل از تجزیه‌وتحلیل بیوشیمی نشان داد که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان CAT، GPX و SOD در شرایط تنش با افزایش استرس افزایش یافت.
در مطالعه‌ای که علی‌رضا پور تقی و همکاران در سال ۲۰۱۱ روی آفتابگردان انجام دادن گزارش کردند که گیاهان تحت تنش نسبت به گیاهان شاهد افزایش قابل‌توجهی در فعالیت تمام آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در برگ مانند سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPX)، گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و کاتالاز (CAT) را گزارش کردند.
درطی مطالعه ای که نظری و همکاران در سال ۲۰۰۸ روی بیان نسبی ژن کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در دو ژنوتیپ نخود دسى و کابلى تحت تنش سرما انجام دادندگزارش کردند ، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در رقم دسی افزایش و در رقم کابلی کاهش یافت. میزان بیان ژن آسکوربات پراکسیداز در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت. این افزایش نشان داد که این آنزیم می تواند در تنش سرما پاسخ دهد و کمبود کاتالاز در رقم کابلی را جبران کند. پاسخ به دماى سازگارى و تنش سرما مى تواند در زمان کوتاهى پس از قرارگیرى در شرایط تنش آغاز شده و این زمان کوتاه سازگارى مى تواند برخى از گیاهان نخود را جهت تحمل به تنش هاى شدیدتر آماده سازد.
در بررسی تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن کاتالاز و ارتباط آن با میزان پراکسید هیدروژن در گیاه گندم توسط چلینا (۲۰۰۴) انجام شد مشخص کرد که تجمع پراکسید هیدروژن با کاهش محتوای نسبی آب برگ ارتباط مستقیم داشته و با کاهش محتوای نسبی آب برگ میزان تولید پراکسید هیدروژن افزایش می یابد و با افزایش میزان پراکسید هیدروژن میزان بیان ژن کاتالاز افزایش یافته که به دنبال آن فعالیت آنزیم کاتالاز دو برابر می شود. مقررات پیچیده ای از الگوهای بیان شده از بیان ژن کاتالاز در سطح ترجمه در شرایط شب و روز وجود دارد که اجازه می دهد تا کنترل دقیق میزان پراکسید هیدروژن در برگ صورت گیرد.
مطالعه ای توسط لیکسین و همکاران در سال ۲۰۱۱ روی دو رقم مقاوم و حساس کنتاکی بلوگراس در پاسخ به تنش خشکی انجام شد هدف این مطالعه بررسی پاسخ های آنزیم آنتی اکسیدان به تنش خشکی بود.مطالعات نشان می دهد که زمانی که میزان محتوای نسبی آب به ۲۶ تا ۲۸ درصد رسید افزایش فعالیت آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز در رقم حساس افزایش یافته که در مهار گونه های اکسیژن فعال از طریق تغییرات در سطح بیان ژن مشاهده شد.نتایج نشان میدهد افزایش میزان بیان در رقم حساس بیشتر از رقم مقاوم مشاهده شد و نتایج فعالیت آنزیم نشام می دهد که آنزیم های دخیل در چرخه آسکوربات پراکسیداز نقش مهمی در حفاظت آنتی اکسیدانی در برابر آسیب خشکسالی دارند.
در مطالعه ای که انسل و همکاران در سال ۲۰۱۱ دربررسی بیان ژن و فعالیت آنزیمی تحت تنش خشکی در گیاه برگ لوبیا چشم بلبلی انجام شد گزارش کردند که گونه های اکسیژن فعال در گیاهان اغلب در زمانی که گیاه در معرض تنش های غیر زنده قرار می گیرند تولید می شوند دو آنزیم پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز نقش کلیدی در مهار گونه های اکسیژن فعال دارند .آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز بر روی واکنش های اکسیداسیون و احیا نقش دارند .نتایج نشان داد که در شرایط تنش خشکی میزان بیان ژن گلوتاتیون ردوکتاز در بافت برگ افزایش یافته و میزان افزایش رابطه مستقیمی با شدت تنش دارد.
در بررسی های داکوستا و همکاران در سال ۲۰۰۷ روی تغییرات درفعالیت آنزیم آنتی اکسیدان و پراکسیداسیون لیپیدی روی سه گونه ازگیاه بنت گراس تحت تنش خشکی انجام شد مشاهدات حاکی از آن بود که در هر سه گونه کاهش عمومی در فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانت و افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی گزارش شد تنش خشکی طولانی مدت باعث آسیب اکسیداتیو در هر سه گونه شد گونه بنت گراس مخملی بیش ترین توانایی را در مهار اکسیداتیو را دارا می باشد.
در مطالعه ای که لونا و همکاران در سال ۲۰۰۶ روی تجمع پراکسید هیدروژن و فعالیت و بیان ژن کاتالاز درگندم انجام دادند به این نتیجه رسیدند که تجمع پراکسید هیدروژن ناشی از خشکسالی با کاهش محتوای آب خاک و جذب کربن دی اکسید در ارتباط است.فعالیت آنزیم کاتالاز تحت شرایط تنش خشکی شدید دوبرابرشد.
فصل سوم
مواد و روش­ها
۳-۱ تهیه مواد گیاهی

برای جلوگیری از رشد قارچ و جلبک، استوک­ها در یخچال و در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند. طی دوره رشد گیاه، برای جلوگیری از ظهور جلبک بر روی پرلیت و محلول غذایی که یکی از مشکلات کشت­های هیدروپونیک است، اطراف ریشه دانه­رست­ها و روی محلول غذایی، نایلون­های مشکی کشیده شد. با بزرگتر شدن گیاه این مشکل از بین می­رود و نیازی به استفاده از این نایلون­ها نیست.

شکل ۲-۲٫ استفاده از نایلون­های مشکی در اطراف ریشه­ گیاه و محلول غذایی برای جلوگیری از رشد جلبک

اعمال تنش خشکی
تنش خشکی توسط پلی اتیلن گلیکول ۶۰۰۰ در غلظت ۲۰% به مدت ۴۸ ساعت اعمال شد.

تیماردهی
پس از ۴۸ ساعت تنش خشکی به مدت ۹ روز تیماردهی به گلدان­ها آغاز شد. به این صورت که به گلدان­های شاهد محلول هوگلند و به سایر گلدان­ها نانوکلات پتاسیم در سه غلظت ۱۵- ۲۵ و ۳۵ ppm به­ صورت محلول دهی داده شد.

نمونه­برداری
اولین نمونه برداری قبل از اعمال تنش خشکی صورت گرفت. پس از اتمام تنش، دومین نمونه­برداری انجام شد. سایر نمونه­برداری­ها پس از تنش در انتهای روزهای سوم، ششم و نهم از هر یک از تیمارها صورت گرفت. برگ­ها به­ صورت تصادفی در فاصله میان ­گره­های دوم و سوم چیده شدند و داخل فویل قرار داده شدند. نمونه­ها پس از فریز شدن داخل ازت مایع، به فریزر ۷۰- منتقل و تا زمان آنالیز نگهداری شدند.
۲-۹ سنجش پرولین
جهت اندازه ­گیری پرولین مطابق روش بتس و همکاران Bates, et al. 1973)) انجام شد. این روش بر اساس تشکیل یک ترکیب رنگی در اثر واکنش میان اسید آمینه پرولین آزاد و معرفی به نام ناین هیدرین (با فرمول C₉H₆O₄ و جرم مولکولی ۱۵/۱۷۸ گرم بر مول) در شرایط اسیدی و دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد و سپس تخلیص این ترکیب رنگی به کمک یک حلال آلی غیر قطبی مانند تولوئن استوار است. در اثر ترکیب پرولین و ناین هیدرین، ماده­ای رنگی به نام دی کتوهیدرین دیلیدین ایجاد می­ شود. شدت رنگ این ترکیب وابسته به مقدار پرولین می­باشد و با اندازه ­گیری جذب نوری می­توان به مقدار پرولین پی برد. در این آزمایش ابتدا ۵/۰ گرم ماده تر گیاهی در ۵ میلی لیتر محلول ۳ درصد سولفوسالیسیلیک اسید ساییده شد. پس از صاف نمودن مخلوط با کاغذ صافی واتمن شماره ۲، ۲ میلی لیتر از آن در لوله آزمایش ریخته و ۲ میلی لیتر معرف اسید نین هیدرین (۲۵/۱گرم نین هیدرین در اسید استیک۲۰درصد) و ۲ میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه گردید. لوله­ها به مدت یک ساعت در بن ماری دمای۱۰۰ درجه قرار گرفتند و سپس به حمام یخ منتقل شدند. آنگاه ۴ میلی لیتر تولوئن به هر لوله اضافه شد و پس از تکان دادن لوله­ها، مدت ۲۰ ثانیه ثابت نگه داشته شدند تا اینکه دو لایه مجزا تشکیل شد. سرانجام جذب لایه فوقانی (حاوی تولوئن و پرولین) در طول موج ۵۲۰ نانومتر خوانده شد و مقدار پرولین با بهره گرفتن از منحنی استاندارد تعیین شد.
منحنی استاندارد با در دست داشتن غلظت­های مختلف پرولین و جذب هر کدام از غلظت­ها رسم و معادله منحنی استاندارد به­دست آمد.
منحنی استاندارد پرولین
۲-۱۰ سنجش پروتئین کل به روش برادفورد
۲-۱۰-۱ تهیه معرف^[۱] برادفورد:
معرف برادفورد شامل۱۰۰میلی گرم پودر کوماسی بریلیانت بلو G-250 ،۵۰ میلی گرم اتانول ۹۶%. ۱۰۰میلی لیتر اسید فسفریک (w/w)85 درصد می باشد. این سه ماده را با هم مخلوط کرده و به حجم ml 200 می­رسانیم. به این ترتیب محلول x5 به­دست می ­آید که باید در ظرف تیره نگهداری شود. در زمان آزمایش، محلول فوق را ۵ بار رقیق می­کنیم تا محلول x1 به­دست آید.
برای تهیه محلول استوک mg/ml1 آلبومین سرم گاوی (BSA)، مقدار معینی (۱میلی گرم) از این پروتئین را در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در زمان استفاده آن را ده برابر رقیق می­کنیم. حال از این غلظت در لوله‏های آزمایش به­ترتیب۰، ۵، ۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵، ۳۰ و ۳۵ و۴۰و ۴۵ ماکرولیتر BSA می­ریزیم و با آب مقطر به حجم ۵۰ می­رسانیم و به هر کدام ml 5/2 محلول برادفورد x1 با رعایت فاصله­ی زمانی ۲ دقیقه اضافه می‏کنیم و به مدت ۲۵-۳۰ ثانیه لوله­ها را ورتکس می­کنیم. بعد از ۱۵ دقیقه جذب لوله­ها در طول موج ۵۹۵ نانومتر با ر عایت همان مقدار فاصله­ی زمانی با اسپکتروفتومتر می­خوانیم. به این ترتیب منحنی استاندارد (جذب علیه (mg/ml)BSA)رسم شده و به کمک آن و با بهره گرفتن از شیب خط منحنی، غلظت پروتئین کل محاسبه شد.
۲-۱۱ سنجش کلروفیل و کاروتنوئید
۵/۰ گرم برگ تر از هر تکرار توزین شده و توسط نیتروژن مایع در داخل هاون چینی آسیاب شد و به آن ۵ میلی­لیتر استون ۸۰ درصد (۲۰ آب مقطر: ۸۰ استون) اضافه گردید. مخلوط به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه با دور (rpm)3000 در دمای ۴ درجه سلسیوس سانتریفیوژ گردید. در نهایت عصاره استونی شفاف جدا شده و حجم آن با استون خالص به ۵ میلی لیتر (حجم اولیه) رسانده شد. سپس شدت جذب محلول در طول موج­های ۴۷۰، ۶۴۶ و ۶۶۳ با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر (CamSpec M501 UV/Visible) در مقابل شاهد قرائت شد. در نهایت برای تعیین مقدار کلروفیل و همچنین کاروتنوئید کل از فرمول­های زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Chl.a= (12.25 A₆₆₃–۲٫۷۹ A₆₄₆) ×V/W
Ch1.b=(21.50 A₆₄₆–۵٫۱ A₆₆₃)×V/W
Chl.T= Chl.a + Chl.b
Car.=(1000 A₄₇₀ – ۱٫۸۲ Chl.a – ۸۵٫۰۲ Chl.b)/198×V/W
که در روابط بالا V حجم استن به میلی لیتر و W وزن تر برگ بر حسب گرم می‌باشد. غلظت کلروفیل و کاروتنوئید کل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ می­باشد.
۲-۱۲ اندازه ­گیری مالون دی آلدهید
برای این منظور ۵/۰ گرم از بافت برگ در هر تکرار با ml5 تری کلرواستیک اسید ۵% ساییده شد. عصاره حاصل، به مدت ۱۵ دقیقه، در دمای اتاق و با دور rpm)) 14000 سانتریفیوژ شده و سپس محلول رویی توسط سمپلر جدا شد. پس از آن به حجم مساوی از محلول رویی (سوپرناتانت) TCA20درصد حاوی۵/۰ درصد TBA افزوده گردید. مخلوط حاصل به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب جوش با دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد قرار داده و بلافاصله درظرف یخ سرد شد؛ سپس ۲۰۰۰ میکرولیتر از سوپرناتانت به میکرتیوپ منتقل و به مدت ۵ دقیقه در دور rpm)) 7500 سانتریفیوژ شد. سپس جذب کمپلکس MDA+TBA در nm 532 قرائت شد. جذب بقیه رنگیزه­های غیراختصاصی در nm 600 تعیین شد و از میزان جذب در nm 532 کسر گردید. برای محاسبه غلظتMDA از ضریب خاموشی mM^-1cm^-1155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول واکنش پراکسیداسیون لیپیدهاست، بر اساس نانو مول در گرم وزن تر محاسبه شد.
۲-۱۳ استخراج آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
به منظور استخراج عصاره آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی مثل فنل از متانول ۸۰% استفاده شد. ابتدا برگ توتون را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۸ درجه سانتی ­گراد در آون قرار داده تا نمونه­ها کاملا خشک شوند. سپس نمونه­ها را در هاون چینی ریخته و به خوبی کوبیده شد تا کاملا خرد شوند. سپس ۵/۰ گرم از هر نمونه آسیاب شده وزن شده و به لوله­های شیشه ­ای دارای برچسب با ذکر مشخصات انتقال داده شد. سپس به لوله­ها ۵ میلی لیتر متانول ۸۰% اضافه و به­آرامی مخلوط شد. نمونه­ها ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه شیک شدند. بعد از سپری شدن این زمان، عصاره­ها با بهره گرفتن از کاغذ صافی واتمن، صاف شده و عصاره­های صاف شده به مدت ده دقیقه در دور (rpm) 1500 سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ، محلول رویی با دقت برداشته شده و به لوله­های شیشه ­ای با ذکر مشخصات انتقال داده شدند. سپس در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی ­گراد برای مراحل بعدی نگهداری شدند.
۲-۱۳-۱ سنجش آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی
از بین آنتی اکسیدان­های غیر آنزیمی، سنجش غلظت فنل نمونه­ها با روش رنگ­سنجی و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد.
۲-۱۳-۱-۱ سنجش فنل تام
سنجش مقدار فنل تام با بهره گرفتن از روش Gaoو همکاران انجام شد که نیازمند استفاده از معرف Folin-Ciocalteu و استاندارد گالیک اسید است. برای این منظور ۱۰۰ میکرولیتر عصاره در داخل لوله شیشه ­ای ریخته شد. سپس ۲۰۰ میکرولیتر حلال فولین و ۲۰۰۰ میکرولیتر آب مقطر به آن اضافه شد. پس از گذشت ۳ دقیقه، ۱۰۰۰ میکرولیتر کربنات سدیم ۲۰% در غیاب نور اضافه شد. در نهایت نمونه­ها به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای اتاق گذاشته شدند. بلانک نیز به همین ترتیب با ۱۰۰ میکرولیتر حلال به­جای عصاره آماده شد. بعد از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با بلانک، جذب نمونه­ها در طول موج ۷۶۵ نانومتر خوانده شد.
۲-۱۳-۱-۲ رسم منحنی استاندارد گالیک اسید
جهت به­دست آوردن غلظت فنل تام نمونه، از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده شد. غلظت­های مختلف گالیک اسید شامل: ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر تهیه شد. به این ترتیب که غلظت گالیک اسید ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر را با متانول ۵۰% تهیه کرده و سایر غلظت­ها مطابق جدول (۲-۴) آماده شدند.
جدول ۲-۴

شکل(۳-۵) تصویر SEM از گرافن اکسید ۵۴
شکل(۳-۶) تصویر SEM 6-آمینو اوراسیل ۵۵
شکل(۳-۷) جذب یونهای فلزی توسط برهم کنش های الکترستاتیک روی سطح GO 56
شکل(۳-۸) تصویری از جذب یون های فلزی توسط جاذب ۵۸
فصل اول
مروری بر پیشینه پژوهش و
تحقیق
۱-۱- مقدمه
امروزه نانو تکنولوژی در پیشبرد دانش بشری جایگاه ویژهای یافته و اکتشافات حوزه ی نانو به علوم فیزیک و شیمی جان تازه می بخشد. علم و فناوری نانو توانایی به دست گرفتن کنترل ماده در ابعاد نانو متری و بهره برداری از خواص و پدیده های این بعد در مواد، ابزارها و سیستم های نوین است و در واقع رویکرد جدید در تولید فراورده های مورد نیاز انسان می باشد. به نظر می رسد که علم نانو و علوم مرتبط با آن جدید نیستند. صدها سال است که شیمی دانان از تکنیک های در کار خود استفاده می کنند که بی شباهت به تکنیک های امروزی نانو نیست.
مسیر تحول و شکل گیری علم نانو به شکل امروزی، با کشف محلول کلوئیدی طلا در سال ۱۸۵۷ توسط فارادی آغاز شد و سال ۱۹۵۹، فاینمن ایدهی«فضای زیاد در سطوح پایین»را برای کار با مواد در مقیاس نانو مطرح کرد در سال ۱۹۷۴ برای اولین بار واژهی فناوری نانو توسط تانیگوچی بر زبانها جاری شد و در دهه ی ۱۹۸۰ این ایده به گونه ای وسیع تری توسط دکتر درکسلر مورد بررسی قرار گرفت.

۱-۲- مفهوم نانو^[۶]
نانو یک پیشوند یونانی به معنای کوتوله است. یک نانومتر مقیاسی معادل یک میلیاردم متر(m^9-10) می باشد، که نسبت به قطر موی سر انسان که یک دهم میلی متر است، صد هزار بار کوچکتر است[۱،۲[. مواد در مقیاس نانو، موادی را شامل می شود که ابعادشان در سطع کمتر از یک میکرون است. این اندازه تقریباً پهنایی معادل ۳ تا ۴ اتم می باشد. خواص مواد با چنین ابعاد و اندازه هایی، با مواد متعارف، اساساً متفاوت بوده و به همین لحاظ تحقیقات در حوزه ی نانو مواد،^[۷] روز به روز فعال تر می شود]۳[. از آنجا که خواص مواد قویاً به اندازه ی اجزای تشکیل دهنده و به عبارتی ریزدانه ها وابسته است، موادی که ریزدانه های آنها در مقیاس نانو طراحی می شوند از کیفیت نوینی برخور دارند که در مواد معمولی یافت نمی شود]۴]. اهمیت این مقیاس طولی به این مفهوم بر می گردد که از دیدگاه مکانیک کوانتومی، خاصیت موجی الکترون های داخل ماده و تقابل اتم ها با یکدیگر، از جابه جایی مواد در مقیاس نانومتر اثر می پذیرد[۶،۵[.
۱-۳- فناوری نانو چیست؟
نخستین کسی که واژه ی فناوری نانو^[۸] بر زبانش جاری شد نوریا تانیگوچی^[۹]، استاد دانشگاه علوم توکیو بود که در سال ۱۹۷۴ این واژه را برای توصیف ساخت مواد دقیقی که تولرانس ابعادی آنها در حد نانو متر است، به کار برد]۸،۷٫[ فناوری نانو عبارت از کاربرد ذرات در ابعاد نانو است. به بیان دیگر توانمندی تولید مواد، ابزارها و سیستم های جدید، با در دست گرفتن کنترل در سطوح مولکولی، اتمی و استفاده از خواصی است که در آن سطوح ظاهر می شود[۹،۸ .[دست کاری هوشمندانه و کنترل هدفمند مواد در مقیاس اتمی هدف عمده ی فناوری نانو تلقی می شود[۱۰]. لذا فناوری نانو یک رشته جدید محسوب نمی شود، بلکه رویکرد جدید در تمام رشته‌هاست[۹].
یکی از ویژگی های مهم نانو فناوری، جنبه ی چند رشته ای آن است. به عبارتی، برای درک مفاهیم پایه ای و تدوین قوانین در مقیاس نانو تقریباً به تمام علوم نیاز است. به عنوان مثال به علم زیست شناسی نیاز است؛ زیرا اولاً محصولات نانو فناوری به شدت از سیستم های زیستی تبعیت می کنند، و ثانیاً محصولات نانو کاربردهای چشم گیری در زیست پزشکی دارد. علم فیزیک مورد نیاز است، زیرا دنیای نانو، دنیای تابع موج، تونل زنی کوانتومی و کشف نیروهای اتمی ناشناخته است علم شیمی مورد نیاز است، زیرا روش های پیوند مولکولها با هم دیگر و چگونگی ترکیب مواد را به ما می آموزد.
تعاریف زیادی برای فناوری نانو وجود دارد، در این میان مؤسسه‌ی پیشگامی ملی فناوری نانو در آمریکا^[۱۰]-که نهاد دولتی متولی این فناوری در آن کشور است-تعریفی را برای فناوری نانو ارائه می دهد که سه اصل زیر را در برمی گیرد:
تحقیق و توسعه ی فناوری در سطوح اتمی، مولکولی با ماکرومولکولی(ابر مولکولی) در مقیاس اندازهای در حدود ۱ تا ۱۰۰ نانو متر]۱۰[.
ساخت و به کارگیری ساختارها، ابزارها و سیستم هایی که به علت داشتن ابعاد کوچک یا متوسط خواص و عملکرد نوینی دارند.
توانایی کنترل یا دست کاری در مقیاس اتمی]۸،۷ .[
۱-۴- چرا نانو فناوری؟
شاید این سؤال در ذهن پدید آید که چه چیزی در مقیاس نانو متری وجود دارد که یک تکنولوژی بر پایه آن نهاده شده است؟ آنچه باعث شکل گیری نانو فناوری شده است، ظهور و خواص بی نظیر در این مقیاس است. در مقیاس نانو، اشیاء شروع به تغییر رفتار می کنند و رفتار سطوح بر رفتار تودهای ماده غلبه می کند. در نتیجه برخی روابط فیزیکی که برای مواد معمولی کاربرد دارند، نقض می شود.
با کوچکتر شدن مقیاس مواد، نسبت سطح به حجم افزایش می یابد. بنابراین، نیروهای سطحی اهمیت بیشتری پیدا می کنند. در حقیقت در این مقیاس قوانین فیزیک کوانتوم وارد صحنه می ‌شوند و امکان کنترل خواص ذاتی ماده از جمله نقطه ذوب، خواص مغناطیسی، خواص الکتریکی و حتی رنگ مواد، بدون تغییر در ترکیب شیمیایی ماده وجود خواهد داشت. نسبت سطح به حجم بالا، سبب افزایش واکنش پذیری نیز خواهد شد، و مواد در مقیاس نانو، واکنش پذیرتر می باشند. هم چنین کاتالیزورهایی با کارایی بالاتر خواهیم داشت.
۱-۵- اهمیت فناوری نانو
فناوری نانو رویکردی جدید به علم و فناوری و پژوهش است به عبارت دیگر نگاهی بنیادی از مقیاس مولکولی به دنیای اطراف است.
تحلیلگران بر این باورند که فناوری نانو، فناوری زیستی^[۱۱] و فناوری اطلاعات^[۱۲] سه قلمرو علمی هستد که انقلاب سوم صنعتی را تشکیل می دهند. مهمترین عامل و محرک اصلی رشد فناوری نانو، سود اقتصادی آن می باشد. این رویکرد جدید ریشه در پنجاه سال گذشته دارد و در علوم فیزیک و شیمی ردپای آن دیده می ‌شود]۱۱[. در فناوری نانو قادر به تولید ساختارهایی هستیم که در طبعیت موجود نیست]۱۲[.
علم نانو و فناوری نانو، اطلاعاتی را پیرامون کنترل اندازه ی ساختارهای نانو، توزیع اندازه‌ی این مواد و ترکیبات و نحوه‌ی چیدمان آنها ارائه می دهد. برخی از مزایای فناوری نانو، تولید مواد قویتر و کاهش هزینه های تولید است. تفاوت اصلی فناوری نانو با سایر فناوریها، در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار می ‌گیرد و معیار اصلی آن عناصر پایه است.
عناصر پایه همان عناصر نانو مقیاسی می باشند که خواص شان در حالت نانو در مقایسه با مقیاس بزرگتر تفاوت دارد. مثلاً به دلیل توسعه ی خواص ویژه ی پودرهای بسیار ریز شیمی سطح؛ نظیر تراکم، مقاومت، خواص نوری و واکنشهای سینیتکی؛ تقاضای این پودرهای ریز در حوزه ها و صنایع مختلفی مانند مواد سرامیکی از جمله خواص جالبی که نانو ذرات دارند این است که در رنگهای مختلف یافت می شوند. نانو ذرات طلا بسته به اندازه خود، می توانند نارنجی، ارغوانی، قرمز، یا آبی متمایل به سبز به نظر برسند، اما وقتی این نانو ذرات به هم متصل می شوند رنگشان زرد تبدیل می ‌شود یا محلولهای کلوئید تیتانیم در رنگهای مختلف وجود دارد.
۱-۶- تفاوت فناوری نانو با فناوریهای دیگر
در فناوری نانو تنها کوچک بودن اندازه مد نظر نیست؛ بلکه زمانی که اندازه مواد در این مقیاس قرار می گیرد، خصوصیات ذاتی آنها از جمله رنگ، استحکام، مقاومت در برابر خوردگی و… تغییر می یابد.
در حقیقت اگر بخواهیم تفاوت این فناوری را با فناوری های دیگر بیان نماییم، می توانیم وجود«عناصر پایه»را به عنوان یک معیار ذکر کنیم. عناصر پایه در حقیقت همان عناصر نانو مقیاسی هستند که خواص آنها در حالت نانو مقیاس با خواص شان در مقیاس بزرگتر فرق می کند.
۱-۷- طبقه بندی نانو تکنولوژی
۱-۷-۱-Wet nanotechnology
مطالعه سیستم های بیولوژیکی و سیستم هایی که محیط اطراف شان بر مبنای آب است. ساختارهای نانومتری که می توان مثال زد.
الف)مواد ژنتیکی
ب)غشاءها
ج)آنزیمها و سایر اجزای سلولی
۱-۷-۲- Dry Nanotechnology
در این نوع در سطح علوم دیگر مثل فیزیک و شیمی مطرح است. مثل ساختارهای مولکول کربن.
۱-۷-۳- Nano computational
نانو محاسبات، مدل سازی و شبیه سازی ترکیبات نانو متریک محاسبه و پیش بینی عملکرد ساختارهای به وجود آمده می باشد.
ارتباط نانو با علوم دیگر مثل شیمی، فیزیک، علوم مهندسی و بیولوژیکی و زیر شاخه‌هایشان را می ‌توان به صورت فلوچارت شکل(۱-۱) زیر نمایش داد.

شکل(۱-۱) ارتباط نانو با علوم دیگر
۱-۸- دسته بندی مواد در فناوری نانو
مواد در مقیاس نانو دارای یک بعد(پوششها و لایه ها) دو بعد(نانو سیم و نانو تیوب) و سه بعد(کلوئیدها، کوانتوم دات که ذرات تشکیل دهنده نیمه هادی‌ها هستند و نانو کریستالین ها با دانه بندی) هستند و در مقیاس نانو به دسته های زیر قابل تقسیم هستند:
۱-۸-۱- نانو لایه
۱-۸-۲- نانو پوشش
۱-۸-۳- نانو خوشه
۱-۸-۴- نانو سیم
۱-۸-۵- نانو لوله

انتقاد کردن در واقع شکایت کردن از یک رفتار مشخص، کمی پس از انجام آن توسط طرف مقابل، به صورت سرزنش‌آمیز و همراه با تخریب شخصیت طرف مقابل است. تحقیر کردن به رفتار طعنه‌آمیز و همراه با بدبینی با همسر و ابراز بیزاری اطلاق می‌شود که خود به تعارض بیشتر منجر می‌شود. تدافعی بودن شکلی از سرزنش همسر و نادیده گرفتن نقش خود در تعارض است. دیوار سنگی بودن که به معنای به تاخیر انداختن یا مخالفت کردن با خواسته‌ها و نظرات طرف مقابل و اجتناب از گفتگو کردن است، معمولا به عنوان راه فراری از یک تعارض قریب‌الوقوع انتخاب می‌شود، حال آن که همسر را ناامید می‌کند و تنش را افزایش می‌دهد.
اثرات تعارض زناشویی
اختلافات زناشویی هم‌بستگی نیرومندی با اختلالات روانشناختی متعددی دارند که از آن جمله می‌توان به افسردگی (پرولکس و همکاران، ۲۰۰۷؛ بیچ و همکاران، ۱۹۹۸)، اختلالات اضطرابی (مک لئود، ۱۹۹۴)، سوء مصرف الکل (مورفی و اوفارل، ۱۹۹۴) و اختلالات خوردن (ون دن بروکو همکاران، ۱۹۹۷) اشاره کرد.
تعارض و نارضایتی زناشویی همچنین می‌تواند استرس زوجین را افزایش دهد (بیچ و همکاران، ۱۹۹۰؛ به نقل از پرولکس و همکاران، ۲۰۰۷). خشونت خانگی بر علیه زنان که یکی از نتایج تعارض زوجین است، یکی از شایعترین دلایل طلاق در میان خانواده‌های ترک تبار است (آریکان^[۱۲۸]، ۱۹۹۲؛ به نقل از کاراهان، ۲۰۰۷).
عملکرد زناشویی والدین بر فرزندان نیز تاثیرات منفی بیشماری دارد. پژوهش‌ها نشان داده‌اند تعارض میان زوجین می‌تواند به بروز افسردگی (آنگر و همکاران، ۲۰۰۰)، اختلالات انطباقی (استراند^[۱۲۹]، ۲۰۰۴) و گرایش به سرزنش و نکوهش خانواده (وبر و اوبراین، ۱۹۹۹؛ به نقل از کاراهان، ۲۰۰۷) در فرزندان منجر شود. تعارضات زناشویی منبع استرس محیطی برای فرزندان هستند (هینانت و همکاران، ۲۰۱۳) و با رفتار ناسازگارانه و ناسازگاری‌هایی از جمله خشم، اختلال سلوک و اضطراب در فرزندان ارتباط معناداری دارند (امری۱۹۸۲). روابط زناشویی یکی از ابعاد مهم والدینی هستند و تعارض زوجین می‌تواند اثری منفی بر رابطه والدینی نیز داشته باشد (شمیر و همکاران، ۲۰۰۱).

تعارضات زناشویی والدین بر پاسخ‌های روانشناختی و امنیت هیجانی فرزندان تاثیر می‌گذارند (هارولد و همکاران، ۲۰۰۴)، ممکن است منجر به تخریب یا تضعیف رابطه والد- فرزندی شوند (پترسون و زیل، ۱۹۸۶) و می‌توانند به مشکلات هیجانی متعدد فرزندان منجر شوند (امری، ۱۹۸۲). تعارض زوجین با انزوای اجتماعی و خشم فرزندان و کیفیت کمتر روابط والد- فرزندی مرتبط است (هریست و اینسلی، ۱۹۹۸). تعارض زوجین بر سر فرزندپروری با رابطه فعالانه پدر- فرزندی کمتر و مشکلات رفتاری شدیدتر در مدرسه و در اوقات فراغت هم‌بستگی دارد (کینگ و همکاران، ۱۹۹۵).
استرس
تعریف استرس
استرس یک مشکل عمومی سلامت است که پیامدهای منفی متعددی برای سلامت مانند اضطراب، افسردگی، مشکلات قلبی و عروقی و خودکشی را به دنبال دارد (شارما و راش، ۲۰۱۴). استرس به عنوان موقعیتی توصیف می‌شود که تعادل حیاتی ارگانیسم مورد تهدید قرار می‌گیرد یا ارگانیسم موقعیتی را تهدید کننده درمی‌یابد (واروگلی و دارویری، ۲۰۱۱). سلیه (به نقل از هینکل، ۱۹۷۳) استرس را وضعیتی پویا برای موجود زنده توصیف می‌کند که از تعامل ارگانیسم با محرک یا شرایطی مضر و آسیب‌رسان ناشی می‌شود.
لازاروس و فولکمن (۱۹۸۴) استرس فیزیولوژیکی را رابطه‌ای میان فرد و محیط توصیف می‌کنند که فرد آن را افزون از حد توانایی و امکاناتش برآورد کرده و برای بهزیستی‌اش مخاطره آمیز قلمداد می‌کند. فولکمن (۱۹۸۴) این رابطه میان فرد و محیط را پویا، دو سویه و متقابل توصیف می‌کند. استرس با کاهش منابع توجه در دسترس و در نتیجه کاهش پردازش اطلاعات نامرتبط با موضوع استرس، توجه انتخابی را افزایش می‌دهد (هاسکین^[۱۳۰] و همکاران، ۲۰۱۴).
استرس مستلزم پاسخ رفتاری و هیجانی فرد به رویدادهای ناخوشایند است (ماهونی^[۱۳۱]، ۲۰۰۹). برخی از سطوح پریشانی در پاسخ به عوامل استرس‌زایی تجربه می‌شوند که بر رفتارهای آتی و عملکرد مرتبط با آن رویدادها تاثیر منفی می‌گذارند (کرنیک^[۱۳۲] و لو^[۱۳۳]، ۲۰۰۲). استرس هزینه زیادی بر افراد، جوامع، سازمان‌ها و اقتصاد وارد می‌آورد (کوپر^[۱۳۴] و دیو^[۱۳۵]، ۲۰۰۴).
استرس می‌تواند زمینه‌ساز اختلالات روانشناختی از جمله افسردگی (سانگ^[۱۳۶] و همکاران، ۲۰۱۴)، اضطراب و نیز خودکشی (شارما و راش، ۲۰۱۴) باشد و منجر به بروز بیماری‌های جسمانی از جمله بیماری‌های قلبی عروقی گردد (بارتلت^[۱۳۷]، ۱۹۹۸؛ شارما و راش، ۲۰۱۴). نشانه‌های تنیدگی (استرس) مانند اضطراب، افسردگی، تنش عصبی، بی‌خوابی، اختلال‌های جنسیت، تقلیل شنود، خستگی، کاهش توجه و حالت مراقبت، تقلیل حافظه و همچنین اختلال‌های بدنی کنشی و عضوی مختلف مانند اختلال‌های هضمی، قلبی- عروقی، سردردهای مزمن، ورم روده، تنگی نفس و … در سطح فردی قابل مشاهده است (استورا، ۲۰۰۵؛ به نقل از دادستان، ۱۳۸۶).
استرس را می‌توان نتیجه عدم توازن میان انتظار فرد و ادراک فرد از پدیده‌ها دانست (توسی^[۱۳۸] و توسی، ۱۹۷۰). ادراک غیر قابل کنترل بودن، غیر قابل پیش‌بینی بودن و افزونگی شرایط زندگی اجزای کلیدی موجودیت استرس‌زا است (کوهن و همکاران، ۱۹۹۳؛ لازاروس و فولکمن، ۱۹۸۴).
یک عامل استرس‌زای مشابه می‌تواند تأثیرات متفاوتی بر افراد مختلف داشته باشد؛ برخی از مردم سریع‌تر می‌توانند با این مشکلات کنار بیایند و زودتر از بحران خارج شوند، اما در برخی از افراد عوامل استرس‌زا می‌توانند به مشکلات روان‌شناختی مختلفی منجر شوند (هافمن، ۲۰۰۷).
اگر یک عامل استرس‌زا بتواند به مشکلات روان‌شناختی خاصی منجر شود، می‌توان گفت که آسیب‌پذیر بودن فرد در شکل‌گیری این مشکل دخیل بوده است : این آسیب‌پذیری در درجه اول به آمادگی ژنتیکی فرد برای دچار شدن به یک مشکل خاص بستگی دارد؛ این تئوری شناخته ‌شده روان‌شناختی با عنوان فرضیه آسیب‌پذیری ارثی در برابر استرس به این می‌پردازد که چگونه ممکن است یک مشکل روان‌شناختی به وجود آید (هافمن، ۲۰۰۷). حتی اگر مشخصات و ترکیبات این نوع ژن‌ها را بدانیم، باز هم پیش‌بینی اینکه چه کسی در معرض ابتلا به یک اختلال روان‌شناختی قرار دارد و چه کسی از آن مصون خواهد بود، دشوار است؛ علاوه بر اطلاع از ساختار ژنتیکی فرد، باید بدانیم که چه زمانی ممکن است فرد در معرض یک عامل استرس‌زا قرار گیرد و یا چگونه با آن مقابله خواهد کرد (هافمن، ۲۰۰۷).
تکنیک‌های کاهش استرس علاوه بر کاهش اثرات روانشناختی منفی استرس می‌توانند بر سلامتی افراد تاثیر مثبت نیز داشته باشند، به عنوان مثال کاستن از استرس، ریسک بیماری‌های قلبی و عروقی را در افراد مبتلا به دیابت کاهش می‌دهد (کوف^[۱۳۹] و همکاران، ۲۰۱۴).
مروری بر ادبیات پژوهش توسط واروگلی و دارویری (۲۰۱۱) نشان داد متداول‌ترین تکنیک‌های مقابله با استرس عبارتند از : آرمیدگی تدریجی عضلانی، پاسخ آرمیدگی، آرمیدگی تلقینی، بیوفیدبک، تصویرسازی هدایت شده، نفس عمیق دیافراگمی، مراقبه معنوی، رفتار درمانی شناختی، کاهش استرس مبتنی بر ذهن‌آگاهی و تکنیک آزادسازی هیجانی.
منابع استرس
منابع تنیدگی ممکن است درون شخص، خانواده یا جامعه باشد (حاتمی، ۱۳۷۷). منابع استرس را می‌توان به چند دسته تقسیم کرد :

• • محیط

• • عوامل استرس‌زای اجتماعی

• • عوامل فیزیولوژیکی

• • افکار (دیویس^[۱۴۰] و همکاران ،۱۹۹۵)

بارتلت (۱۹۹۸) اشاره می‌کند منابع درونی استرس عموما یکی از موارد زیر هستند :

• • ترس‌ها (مانند ترس از پرواز، ارتفاع، سخنرانی یا صحبت در جمع، گفتگو با غریبه‌ها)

• • الگوهای فکری تکرار شونده

• • نگرانی از رویدادهای آتی

• • انتظارات غیر واقع‌بینانه یا ایده‌آل‌گرایانه

برخی از الگوهای تفکر می‌توانند منجر به بروز استرس در فرد شوند، مانند :

• • برنامه‌ریزی بیش از حد

• • جرأت‌مند نبودن

• • ناتوانی در تعیین محدوده‌ سلامتی

• • به تعویق انداختن یا شکست در برنامه‌ریزی برای آینده (گاردنر^[۱۴۱] و تیلور^[۱۴۲]، ۱۹۷۵).

انواع استرس‌ و استرس‌زاها
استرس را می‌توان بر دو نوع دانست : استرس مثبت و استرس منفی (گرینبرگر^[۱۴۳] و پادشی^[۱۴۴]، ۱۹۹۵).
برای استرس مثبت می‌توان ویژگی‌های ذیل را برشمرد :

• • برانگیزاننده، مشوق و افزایش دهنده انرژی است

• • کوتاه مدت است

• • در حوزه توانایی‌های مقابله‌ای فرد قرار دارد

• • هیجان‌انگیز و جالب احساس می‌شود

• • عملکرد فرد را بهبود می‌بخشد (ایوانز و همکاران، ۲۰۱۱)

در مقابل استرس منفی چنین ویژگی‌هایی دارد :

جلّز خدای ما همیشلی بود
هر که بنده‌ی خدان، بگه یا خدا
یا خدا
بابا خار کنی بود که یک زن و یک دختر داشت و توی یک خونه‌ی فسقلی زندگی می‌کردند. بابار خار کن روزها می‌رفت خارکنی، کوله باری خار به شهر می‌آورد و می‌فروخت، نان بخور و نمیری گیرشان می‌آمد، می‌خوردند و شکر خدا را می‌کردند.
یک روز بابا خار کن صبح خیلی زود میلش کشید که پکی به قیلون (قلیون) بزند روکرد به دخترش و گفت:
«قیلونی چاق کن بده بکشیم»
دخترو رفت قیلون چاق کند، هر چه گشت آتش ندید. رقت خونه‌ی همسایه که چند حبه‌ی آتش بگیره، دید همه‌شون نشسته‌اند قصه میگن و نخودچی کشمش پاک می‌کنند. گفت:‌ «آمدم، یکی دو حبه‌ی آتش می‌خوام آخه می‌دونید بابام صبح اول صبحی هوس قیلون کرده»!
زن همسایه گفت: «خواهر چه عجله یک دقه (دقیقه) بشین داریم آجیل مشکل‌گشا پاک می‌کنیم اگر می‌خواهی تو هم مثل ما نذر کن، هر ما آجیل مشکل‌گشا بخر، تا بلکه خداوند گره از کار بابات وا کنه»؟
دخترو نشست تا آجیل مشکل‌گشا را پاک کردند، سهمش را گرفت و فاتحه‌اش را خواند. بعد بلند شد چند حبه آتش گرفت و آمد خونه.
بابا خار کن را می‌گی شروع کرد به اوقات تلخی و داد و بیداد کردن.
دخترو گفت:‌ «عوضش برات آجیل مشکل‌گشا آوردم. خودم هم نذر کردم که خداوند گره از کارمون باز کنه.» بابا خار کن قیلونی را که دخترش برایش چاق کرده بود کشید بعد بلند شد و راه صحرا را داد دمش و شروع کرد به خار کند. چند روزی گذشت، یک روز همان جور که داشت خار می‌کند چشمش افتاد به یک بوته‌ی خار خیلی گنده خوشحال شد.

با خودش گفت: «این بوته‌ی خار را که بکنم سور و سات زن و بچه‌م روبرا میشه، واسی امروز هم دیگه بسه»!
بیخ بوته را گرفت و بالا کشید و زیر بوته یک سنگ دید. سنگ را که برداشت دید پله می‌خوره میره پایین. بسم‌الهی گفت و از پله‌ها پایین رفت. نگاه کرد دید خدا بدهد برکت، تا چشم کار می‌کرد طلا و جواهر روی هم کوت شده. یه تکه جواهر برداشت، سنگ را سر جایش گذاشت و به طرف شهر راه افتاد.
رفت پیش جواهرفروشی، جواهرو آب کرد (فروخت). بعد مقداری اثاثیه خرید،‌ گذاشت کول هفت تا حمال گفت: «این‌ها را ببرید خونه‌ی من».
حمال‌ها پرسون پرسون، خونه‌ی بابا خار کن را پیدا کردند. در زدند و گفتند: «که آقا این‌ها را فرستاده، خودش هم از عقب می‌رسد».
دخترو را میگی باور نمی‌کرد. در آمد و گفت: «ی بابا، ما کجا و این همه چیز کجا؟ نه کاکو اشتباه اومدید»؟!
مخلص کلام هر چه حمال‌ها اصرار کردند در دخترو سودی نبخشید. تا این که خود بابا خار کن از راه رسید. کمک کرد اثاثیه‌ها را به داخل خونه بردند.
بابا خار کن سر فرصت همه چیز را برای زن و دخترش تعریف کرد. آن‌ ها که باور نمی‌کردند، ولی کم‌کم همه چیز حالیشون شد.
آن وقت بابا خار کن گفت: «سروصدایش را بلند نکنید. یواش یواش جواهرها را بیرون میاریم و می‌فروشیم. همان جا هم قصری می‌سازیم که از خوبی تو کره خاک لنگه نداشته باشد».
بابا خار کن همین کار را کرد قصری ساخت که بیا و ببین! اتفاقاً حاکم آن شهر که رفته بود شکار گذارش به قصر بابا خار کن افتاد، از دیدن قصر خوشش آمد پرسید: «صاحب این قصر کیه»؟‌
یکی از همراهان گفت: «قربان این قصر لعل سوداگره».
حاکم به بهانه‌ی آب خواستن در قصر را زد. اتفاقاً خود بابا خار کن در را باز کرد.
حاکم گفت:‌ «ممکن است لیوانی آب به من بدهید.»
بابا خار کن گفت:‌ «قابلی نداره».
رفت جام طلایی را پر از آب کرد و آورد. حاکم که از دیدن جام خوشش آمده بود گفت: «به‌به عجب جام زیبایی، هرگز نظیرش را ندیده بودیم»!
بابا خار کن هم گفت:‌ «پیشکش قربان».
حاکم وقتی به شهر رسید ماجرا را برای زن و دخترش تعریف کرد. دخترش خوشحال شد و گفت: «اگر دختری هم داشته باشد که با من دوست بشه، خیلی خوبه»!
رفتند و تحقیق کردند، دیدند که بله دختری هم دارد. دختر بابا خار کن راضی شد که پیش شاهزاده خانم برود. ولی هنوز از قصر بیرون نرفته بود که مادرش بهش گفت: «مادر، یادت نره برگشتن صنار بدی آجیل مشکل‌گشا و با خودت بیاری».
دخترو را میگی گفت: «عجب حوصله‌ داری‌،‌ها؟ آجیل مشکل‌گشا چیه! و در قصر را به هم زد و رفت».
شاهزاده‌خانم از دیدن دختر لعل سوداگر خیلی خوشحال شد. آن‌ ها چون شیر و شکر در هم جوشیدند، تا اینکه روزی شاهزاده خانم گفت:‌ «امروز می‌خواهیم بریم سر چشمه آب‌تنی کنیم، تو هم میایی»؟
دختر لعل سوداگر گفت: «البته که میام».
به سر چشمه رفتند، دختر حاکم گردن‌بند را سر شاخه‌ی درختی آویزان کرد و رفت داخل چشمه… کلاغی هم از راه رسید گردن‌بند را برداشت و رفت.
دختر لعل سوداگر که ناظر این جریان بود از تعجب می‌خواست شاخ در بیاره! آمد و قضیه را برای شاهزاده خانم تعریف کرد.
ولی شاهزاده خانم گفت:‌ «ای بدجنس دروغگو، گردن‌بند را دزدیدی، حالا می‌گی کلاغی اونه دزدیده، حالا خودمونیم، کلاغ گردن‌بند می‌بره»؟!
بیچاره دختر لعل سوداگر هر چه قسم خورد فایده‌ای نکرد که نکرد! هیچی، دردسرتون نمی‌دهم شاهزاده خانم سروصدا کرد. قراول‌ها رسیدند و دختر را بردند. قصر هم به قدرت خدا ناپدید شد. ننه و باباش را هم گرفتند. و هر سه را زندانی کردند.
توی زندان زن بابا خار کن دخترش را شماتت می‌‌کرد و می‌گفت: «همه‌اش تقصیر تو چریکمون زده است! ذلیل مرده اگر نذرت را ادا کرده بودی حالا زندگیمون این جور نبود، خوش و خرم زندگی می‌کردیم».
دخترو شروع کرد به گریه کردن، حالا گریه نکن، کی بکن! آن قدر زار زد که همان جا خوابش برد. تو خواب دید یک آقای نورانی، شال و عمامه سبز آمد بالای سرش، عصایش را به او زد و گفت: «بدان و آگاه باش ای دختر مادرت گفت نذرت را ادا کن، نکردی، این سزاته حالا بلند شو زیر پاشنه در را بگرد، یه صناری پیدا می‌کنی آجیل مشکل‌گشا بخر نذرت را ادا کن».
دخترو از خواب پرید، ولی بعد با خودش گفت: «حتماً چون تو فکر بودم، این خواب را دیدم». باز هم گرفت خوابید. ولی برای بار دوم این خواب را دید. این بار بلند شد و رفت و خاک‌های زیر پاشنه در را گشت. دید درسته، یه دونه صناری اونجا افتاده، صناری را برداشت. زندانبان را صدا کرد و گفت: «والله برادر این صناری را برای من نخودچی کشمش بخر»؟‌
زندانبان گفت: «می‌دونی چه صلاح یا نه؟ من از شما حقه‌بازترم، یکی را پیدا کنید که با هم کلاه سرش بیذاریم.»
کمی بعد مردی آمد رد شد. دختر از او هم همین خواهش را کرد، که او هم راهش را گرفت و رفت. دخترو داشت ناامید می‌شد که سروکله‌ی پیرزنی پیدا شد. دخترو او را صدا کرد و خواهش کرد صنار را نخودچی کشمش برایش بگیرد.
پیرزن گفت: «اگرچه کار لازم دارم، ولی این کار را برات می‌کنم».
رفت و نخودچی کشمش را خرید داد به او و هر سه با هم شروع کردند به پاک کردن آن، بعد فاتحه‌اش را هم خواندند و سهم پیرزن را هم که بیرون ایستاده بود دادند. از آن طرف بشنوید که آمدند و خبر دادند که کلاغی گردن‌بند دختر حاکم را سرچشمه انداخته، فرستادند دختر و پدر و مادرش را از زندان آزاد کردند.
حاکم از آن‌ ها عذرخواهی کرد و گفت: «حتماً باید در این جریان سری نهفته باشد»! بابا خار کن گفت: «درست می‌فرمایید» و ما وقع را مو به مو تعریف کرد.
حاکم خوشحال شد. دستور داد که برای او هم همین نذر را بکنند.
شاهزاده خانم و دختر بابا خار کن باز هم به هم دوست شدند. وقتی بابا خار کن به سراغ قصرش رفت دید، قصرش سر جاشه. خدا را شکر کرد. انشاءالله همان طور که اون‌ها به مراد دلشون رسیدند شما هم اگر مرادی دارید به مراد دلتون برسید، انشاءالله. (فقیری، ۱۳۸۲: ۲۱-۳۳)
نوروز در شیراز
سه روزه رفته‌ای سی روزه حالا زمستون رفته‌ای نوروزه حالا
خودت گفتی سر هفته میایم شمارش کن ببین چند روزه حالا
از یکی دو هفته پیش از عید نوروز شیرازیان به استقبال نوروز می‌روند و به طور کلی جنب و جوشی در میان مردم پدیدار می‌شود بوی عید را می‌توانی بشنوی و این درست زمانی است که می‌توان بوی بهار را در کوچه‌های شیراز استشمام کرد. مرغ‌های نوروزی را کنار رودخانه‌ی خشک می‌توانی ببینی و اگر هوا مناسب و خوش باشد سروکله‌ی گربه‌ نوروزی‌ها هم پیدا می‌شود.
دور دوازده‌‌گانه نوروز
هر سال به نام حیوانی از گذشته‌های دور نام‌گذاری شده چون پرسیده شود امسال چه سال است؟ جواب می‌دهند: «امسال مثلاً سال خرگوش است».