C
پدوویریده ها
گروه B رایج ترین نوع آن هاست که باکتری های اسید لاکتیکی را آلوده می کند. (۶۱)
۱-۸-۷- مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژ:
همانگونه که در تحقیقات دیگر نظیر تحقیقی که دوخسن [۲۷] و همکاران بر روی کنترل باکتریوفاژهای لاکتوکوکال یا تحقیقی که توسط الیس[۲۸] و دلبروک [۲۹] در مورد رشد داخل و خارج سلولی باکتریوفاژها انجام دادند، مشخص شد مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژها بصورت زیر است: (۶۳)
۱-۸-۷-۱- مرحله جذب فاژ بر روی سلول باکتری:
در فاژهای دم دار، زواید دم در چسبیدن فاژ بر روی سلول باکتری نقش دارند. البته فعالیت لیزوزم ها برای بوجود آوردن سوراخ یا نقطه ای در روی دیواره باکتری نیز ضروری است. در فاژهای بی دم بعضی از کپسومرهای موجود در روی کپسید فاژ این عمل را انجام می دهند. برای انجام عمل جذب در محیط حاوی باکتری و فاژ اختصاصی آن، وجود املاحی نظیر کلرید کلسیم یا کلرید سدیم الزامی است.
۱-۸-۷-۲- مرحله ورود فاژ به داخل باکتری:
در فاژهای دم دار با غلاف کوتاه شونده اسید نوکلئیک داخل کپسید، با کوتاه شدن غلاف روی دم و ورود قسمتی از دم به دیواره باکتری، از راه کانال ایجادشده وارد باکتری می شود . بر خلاف ویروس های حیوانی و انسانی فقط اسید نوکلئیک وارد شده و بقیه زوائد مانند مرحله غیرپوشش [۳۰] در تکثیر سایر ویروسها، در خارج از سلول باکتری باقی می مانند بدین معنا که خروج اسید نوکلئیک فاژ از کپسید آن، ضمن ورود آنها به داخل باکتری صورت می گیرد.
۱-۸-۷-۳- بیوسنتز:
در این مرحله اسید نوکلئیک فاژ کلیه اعمال سنتز را خود بر عهده گرفته و این اعمال را در باکتری کنترل می کند. اولmRNA و پروتئینهای اولیه را سنتز می کند که این ها خاصیت آنزیماتیکی دارند و برای ساخته اسید نوکلوئیک جدید به کار می روند و پس از آن mRNA و پروتئین های ثانویه را سنتز می کنند که در ساختمان فاژهای جدید به کار خواهند رفت.
۱-۸-۷-۴- رسیدگی کامل:
در این مرحله اسید نوکئیک تولید شده به حالت فشرده درآمده و توسط کپسومرها احاطه می شود و بالاخره کپسید تشکیل شده و در داخل آن قرار می گیرد همزمان با این اعمال دم فاژها نیز ساخته می شود و در روی کپسید بر محل های مخصوص به خودشان می چسبند و آرام آرام فاژهای جدید تشکیل می شود.
۱-۸-۸- منشا فاژ:
با وجودی که در مورد ارتباط بین فاژهای مختلف اطلاعات زیادی بدست آمده ولی هنوز منشا فاژ مورد بحث می باشد. دو خط سیر مهم برای آلودگی فاژ در تاسیسات لبنی مشخص شده است : آغازگر لیزوژنیک و حضور باکتریهای اسید لاکتیک در شیر خام.
۱-۸-۹- سیکل حیاتی باکتریوفاژ:
سیکل فساد سلولی توسط فاژ، با جذب سطحی آن بر روی دیواره سلولی مربوط به باکتری های حساس میزبان فاژها در حالت کلی دو سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک دارند.(شکل۴)(۵۶)
۱-۸-۹-۱ سیکل لیتیک:
در این سیکل فاژها پس از ورود به داخل باکتری حساس به خود، تکثیر یافته و همانندسازی می کند و باکتری را در نهایت لیز می کنند. لیز شدن باکتری بدین صورت انجام می گیرد که از طرف ژنوم فاژ یک پروتئین لیزکننده بیشتر می شود و این پروتئین، دیواره باکتری را از داخل از بین می برد و دیواره را متلاشی می کند لذا فاژهای تشکیل یافته جدید بیرون می ریزند که در این حالت به آنها فاژ فرزند[۳۱] می گویند که در تماس با باکتری جدید به آن می چسبند و این سیکل دوباره تکرار می شود. عموما باکتریوفاژهای لبنی از این سیکل پیروی می کنند و به این فاژ، فاژ فعال[۳۲] نیز گفته می شود.
۱-۸-۹-۲- سیکل لیزوژنیک:
این فاژها بصورت معتدل [۳۳] زندگی می کنند بدین معنی که بعد از ورود به باکتری، رشد و تکثیر نیافته و باکتری را لیز نمی کنند. بلکه فاژ پس از اتصال به دیواره سلولی باکتری، ژنوم خود را وارد سلول باکتری می نماید. ژنوم فاژ به ژنوم باکتری چسبیده، ادغام شده و همراه رونویسی[۳۴] ژنوم باکتری با کروموزوم آن تقسیم شده و به نسل های بعدی منتقل می شود و به نام پروفاژ[۳۵] معروف است و به این عمل لیزوژنیک می گویند. این نوع فاژ، فاژ معتدل نیز نامیده می شود.
شکل ۱-۴- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ
۱-۸-۱۰- روش های جداسازی فاژ
۲ نوع روش جداسازی فاژ وجود دارد : روش مستقیم و غیر مستقیم
۱-۸-۱۰-۱- روش مستقیم:
روش جداسازی مستقیم بر روی حضور ذرات فاژ لیتیک یا ترکیبات آن ( DNA و پروتئین ) تمرکز می کند.
۱-۸-۱۰-۱-۱- روش های میکروبیولوژی:
روش های استاندارد میکروبیولوژی عبارتند از : سنجش پلاک، تست لکه [۳۶]و تست های فعالیت که معمولا برای شیر یا محصولات تخمیری انجام می شود. یکی از مزیت های این نوع تکنیک تشخیص مهار کننده های فاژی و غیر فاژی است. ضعف این روش این است که به سویه های اندیکاتور حساس است و دیگر اینکه زمان نسبتا طولانی برای بدست آوردن نتایج لازم است.(۴۹)
۱-۸-۱۰-۱-۲- روش مولکولی:
جداسازی مولکولی روشی مقدم و اختصاصی است بدلیل اینکه این نوع سنجش در مدت زمان کوتاهتر از روش های دیگر انجام می گیرد. چندین روش پایه ای PCR طراحی شده است و در جداسازی موفقیت آمیز بوده و حتی برای طبقه بندی فاژهای لاکتوباسیل، لاکتوکوکوس ها و استرپتوکوکوس ها در مخلوط های لبنی که شامل آب پنیر، استارتر های آب پنیر و نمونه های شیر است مورد استفاده قرار می گیرد.
محدودیت جداسازی روش یک مرحله ای PCR کلاسیک معمولا ۱۱۰۴-۱۰ ۷PFU.ml- می باشد.
این روشی، روشی با حساسیت بالا و سریع می باشد. در مطالعات اخیر این متد برای جداسازی و شمارش سه گروه فاژ لاکتوکوک به نام های C2, P335,936 که از شیر خام بز و پنیر با محدودیت جداسازی پایین ۱۰۲ PFU.ml-1 و در حدود دو ساعت به طول انجامیده استفاده شده است.
روش مولکولی ذرات فاژ فعال و غیر فعال را تشخیص می دهد از این حیث کهDNA فاژ را جداسازی
می کند. تکنیک جداسازی مولکولی برای آزمایشات روتین مقرون به صرفه نیست و اختصاصی عمل
می نماید. این روش فقط فاژهایی را که سکانس ژنومیک آنها در دسترس باشد جداسازی می کند، چون بر پایه ی جداسازی DNAمی باشد.
۱-۸-۱۰-۲- روش های غیر مستقیم سنتی:
۱-۸-۱۰-۲-۱- تست فعالیت
تست فعالیت یک ابزار عمومی برای انالیز روتین در کارخانه های لبنی می باشد. حضور فاژ در محصولات لبنی ( در مقایسه با نمونه های کنترل شده فاقد فاژ ) سبب کاهش تولید اسید می شود.
اهمیت محدودسازی برای این سنجش ها به خصوص برای آغازگرهای مخلوط چند سویه باید در نظر گرفته شوند چون سویه هایی که به فاژ غیر حساس هستند به رشد و اسیدی شدن ادامه می دهند.
۱-۸-۱۰-۲-۲- تست اندیکاتور
اگر فاژ در نمونه باشد تاخیر یا شکست در تغییر رنگ ( عمدتا متیلن بلو یا برموکرزول پرپل) مشاهده می شود. همانطور که در تست فعالیت ممکن است حضور فاژ نتایج منفی کاذب را بدهد در تست اندیکاتور نیز نتایج منفی کاذب را نیز خواهیم داشت.(۴۹)
۱-۸-۱۰-۲-۳- فلوسایتومتری[۳۷]
در چندین سال گذشته برای جداسازی ویروس ها از آب دریا استفاده شده است. در این روش اسید نوکلوئیک را رنگ آمیزی می کنند و فاژهای آزاد موجود در نمونه بدون توجه به میزبان آن ها قابل شمارش است.
اخیرا جداسازی فاژهای لاکتوکوک آلوده کننده از طریق روش فلوسایتومتری گزارش شده است محدوده جداسازی این روش PFU.ml -۱ ۱۰۵ می باشد که باروش PCR کلاسیک قابل مقایسه است.
در این روش ذرات بزرگ مانند سلول های یوکاریوتیک و ذرات چربی باید برداشته شوند تا از بلوکه شدن فلوسایتومتری جلوگیری شود.(۴۹ ،۶)
۱-۸-۱۰-۲-۴- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر
آلودگی فاژ سبب کاهش تولید اسید لاکتیک در شیر خواهد شد. در مطالعه اخیر Garcio-Aljaro و همکارانش روش جداسازی سریع را که بر اساس تغییرات امپدانس میزبان روی میکروالکترود فلزی (پلاتین و طلا) است، مورد مطالعه قرار دادند. آلودگی و پیامد لیز سلول میزبان توسط اسپکتروسکوپی، امپدانس غیر فاراد در نمونه های شیر مورد سنجش قرار گرفت. سادگی این روش از مزیت های آن است.
اخیرا ترکیب روش میکروسکوپی epiflurecence و میکروسکوپی Atomice force (AFM) برای سنجش حضور فاژها گزاررش شده است.
با بهره گرفتن از روش میکروسکوپی epiflurecence ذرات فاژ لاکتوباسیلوس هلوتیکوس شمارش شده است در حالی که روش میکروسکوپی AFM به سنجش و بررسی تغییر در فاژ و جمعیت های باکتریایی در طی مراحل آلودگی می پردازد.
ذرات فاژ توسط SYBR GreenI رنگ آمیزی می شود و سپس نور سبز ساطع می شود در نتیجه ذرات درخشان بزرگتر از اندازه واقعی ویریون دیده می شوند و با میکروسکوپ فلورسنس قابل شمارش هستند. معایب این روش بدین صورت است که ذرات فاژ ویرولانت و غیر ویرولانت هر دو شمارش می شوند.
۱-۸-۱۰-۲-۵- سنجش پلاک/ لکه و رشد/ تاریکی[۳۸]
این دو روش به طور دائم مورد استفاده قرار می گیرد. این سنجش بر اساس مهار رشد سویه های میزبان توسط باکتریوفاژ صورت می گیرد. کاهش تولید اسید لاکتیک سبب کاهش رشد سویه های میزبان می شود.
گرچه روش های تشخیص میکروبیولوزی از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است اما دارای خصوصیات نامطلوب هم می باشد.
این فرایندها در مدت زمان طولانی صورت می گیرد، حداقل ۲۴ ساعت زمان لازم است همچنین باکتریوفاژها دارای میزبان اختصاصی هستند و یک فاژ یک یا تعداد کمی از سویه های باکتری را آلوده می کند و برای انجام این تست ها مجبور به حفظ گروه بزرگی از باکتری های اسید لاکتیک هستیم علاوه بر این به نتایج منفی حاصل از این تست ها هیچ اطمینانی نیست که الزاما فاقد فاژ باشند.
فرم در حال بارگذاری ...
