وبلاگ

۲-۳-۳- ذخایر CNS
گلوتامات و آمینواسیدهای اسیدی دیگر در همه سلول ها با غلظت های بالا وجود دارند.
بزرگترین ذخیره گلوتامات که حدود ۵۰% از کل ذخایر موجود را تشکیل می دهد مربوط به متابولیسم نورونها می باشد و به عنوان metabolic pool شناخته می شود. یک ذخیره کوچکتر نورونی ( ۳۰% - ۲۰ از کل) قابل آزاد شدن از انتهای اعصاب در طول نوروترانسمیشن است و بنام glutamate neurotransmitter معرفی می شود.
یک ذخیره جداگانه (۲۰% - ۱۰ از کل) در سلول های گلیال است و در جهت recycling گلوتامات به عنوان ترانسمیتر عمل می کند ( glial pool). کوچکترین ذخیره گلوتاماتی (۵% از کل) در سنتز GABA شرکت می کند [۷۷]GABA precursor pool)).
۲-۳-۴- نحوه آزادسازی متابولیسم و ترانسپورتر اختصاصی
ترانسمیتر گلوتامات در بخش پیش سیناپسی انتهای اعصاب گلوتاماترژیک در وزیکول ها وجود دارد و می تواند بوسیله مکانیسم وابسته به کلسیم آزاد شود [۷۷].از فضای بین سیناپسی توسط یک سیستم باز جذب با تمایل بالا که وابسته به سدیم است برداشت می شود این سیستم بین گلوتامات و آسپارتات تفاوت قائل نمی شود. گلوتامات سیناپسی جذب سلول های گلیال می شود تا بصورت چرخه گلوتامات / گلوتامین بازگردانی شود. اولین مرحله این چرخه آمینه شدن گلوتامات به گلوتامین توسط آنزیم گلوتامین سنتتاز انحصاری گلیال می باشد. گلوتامین حاصله سریعا از غشا سلول عبور کرده و به انتهای اعصاب پیش سیناپسی بر میگردد و در آنجا بوسیله آنزیم گلوتامیناز به شکل ترانسمیتری گلوتامات در می آید. حذف سریع گلوتامات و ترانستیرهای وابسته به آن از شکاف سیناپسی توسط باز جذب با تمایل بالا باعث می شود که اولا به سیگنال تحریکی خاتمه داده شود ثانیا غلظت گلوتامات خارج سلولی در سطح پایین نگه داشته شود بحدی که ایجاد آسیب های cytotoxic نکند ثالثا recycling ترانسمیتر حاصله و منابع ذخیره ای گلوتامات را حفظ می نماید[۷۸].
همانطوری که سیستم های گیرنده ای مختلفی برای گلوماتات شناسایی شده است، شواهد دلالت دارد بر اینکه ترانسپورترهای اختصاصی و مجزا نیز برای آمینواسیدهای تحریکی وجود دارد که از میان آنها ترانسپورتر وابسته به یون سدیم با تمایل بالا بارزترین و بر جسته ترین نوع آنها می باشد.

ترانسپورتر پروتئینی که وابستگی شدیدی به +Na نشان می دهد بصورت واضحی enantioselective است ( مثلا D – آسپارتات، L- گلوتامات را جذب می کند اما D – گلوتامات برای آن سوبسترا محسوب نشده و آن را برداشت نمی کند ).مهار کننده های باز جذب عموما شامل a – آمینواسیدهایی هستند که یک گروه اسیدی اضافی دارند ترکیبی بنام dihydrokainate قادر به مهار کردن باز جذب است. یکی از قویترین و انتخابی ترین مهار کننده های باز جذب ترکیب L- trans-2,4-PDC است این مهار کننده اثری روی باز جذب KA, NMDA AMPA/ که متعاقبا معرفی خواهند شد نشان نمی دهد.
Rigid بودن مهار کننده در اختصاصی بودن آن موثر است[۷۹]. به نظر می رسد یک ترانسپورتر با Conformation های مختلف می تواند چند ترکیب مختلف را انتقال دهد لذا در صورت انعطاف پذیر بودن مولکول مهار کننده همه اشکال فضایی ترانسپورتر مهار می گردد و ما یک مهار غیر اختصاصی خواهیم داشت اما در صورتی که قدرت انعطاف پذیری را از مولکول مهار کننده سلب کنیم در این صورت مهار اختصاصی باز جذب یک ترکیب را خواهیم داشت.
شکل ۲-۶:انواع گیرنده های گلوتاماتی ۱- گیرنده هایNMDA 2- گیرنده هایnon-NMDA[126]
۲-۳-۵- انواع گیرنده ها
گیرنده های گلوتاماتی چنانکه گفته شد شامل دو خانواده متابوتروپیک metabotropic و یونوتروپیک ionotropic می باشد. گیرنده های یونوتروپیک خود به دو دسته non- NMDA , NMDA تقسیم می گردند. گیرنده های non- NMDA نیز به دو گروه AMPA , KA تفکیک شده اند. که از این میان تنها به بررسی گیرنده های NMDA می پردازیم.
گیرنده های متابوتروپیک گلوتامات mGLu با دو مکانیسم پیش و پس سیناپسی ترانسمیشن را تنظیم می نمایند. گیرنده های مذکور بر اساس قرابت ساختمانی و مکانیسم بعد گیرنده ای به سه گروه تقسیم شده اند. گیرنده های متابوتروپیک گلوتامات یک خانواده از گیرنده های جفت شده با G-pr8 هستند (GPCR) که بر اساس ساختاری و مکانیسم بعد گیرنده ای به سه دسته تقسیم می شوند.
گیرنده های گروه I گلوتامات (mGlu5 , mGlu1) با فسفولیپاز C جفت می شوند. گیرنده های گروه II گلوتامات شامل mGlu3 , mGlu2 هستند و رسپتورهای گروه III گلوتامات شامل mGlu7 , mGlu6 mGlu8 , mGlu4 می باشند که با آدنیل سیکلاز جفت شده اند[۸۰].
گیرنده های mGlu بصورت همودینامر می باشند[۸۱]. که نیاز به دو مولکول از لیگاندهای orthosteric مانند گلوتامات برای عملکرد کامل دارند[۸۲].
بیشتر داده های بدست آمده از پتانسیل ضد اضطرابی آنتاگونیست گیرنده گروه I گلوتامات حمایت می کند[۸۳].
از بین همه لیگاندهای گیرنده mGlu ، آنتاگونیست گیرنده mGlu5 پتانسیل بالایی برای اثرات ضد اضطرابی و ضد افسردگی ارائه می کند[۸۴].
گیرنده های mGlu5 بطور فراوان در نواحی CA3 , CA1 واقع در هیپوکامپ، سپتوم، بازال گانگلیا، آمیگدال و نوکلئوس آکومبنس بیان می شوند[۸۵, ۸۶].
گیرنده های گروه II بصورت فراوان در نواحی از مغز که با حالات احساسی مرتبط هستند بیان می شوند. از جمله این نواحی می توان آمیگدال هیپوکامپ و کورتکس Perfrontal را نام برد به نظر می رسد که آگونیست های گیرنده های mGlu II پتانسیل ضد اضطرابی دارند اما بکار بردن این ترکیبات وابسته به نتایج مطالعات کلینیکی در آینده می باشد.[۸۷, ۸۸] دانسته های ما درباره عمل ضد اضطرابی لیگاندهای گیرنده mGlu III بسیار اندک می باشد. لذا بحث درباره مکانیزم های مسئول برای پتانسیل اثرات شبه ضد اضطرابی که مربوط به لیگاندهای گیرنده های mGlu4/7/8 می باشد بسیار مشکل است[۸۹].
گیرنده های NMDA ابتدا بصورت فارماکولوژیک بوسیله آگونیست N-Methyl –D- Aspartate (NMDA) شناسایی و از دیگر گیرنده های گلوتاماتی تفکیک گردید.تحقیقات اخیر روی زیر گروه های این گیرنده مشخص کرده است که فعالیت آن بوسیله چندین جایگاه اتصالی آلوستریک و نیز با همراهی سایر گیرنده ها و از جمله AMPA/KA تنظیم می شود.گیرنده های NMDA به کانالهای کلسیمی جفت شده اند تنظیم دقیق فعالیت این کانالها چنانکه در قسمت های بعدی توضیح داده خواهد شد برای عملکرد طبیعی اعصاب ضروری است[۸۶].
فعالیت گیرنده و دپلاریزاسیون همزمان عصب پس سیناپسی منجر به پیشرفت یک جریان آهسته بالا رونده و طولانی مدت بوسیله influx یون کلسیم می شود. زیر گروه های گیزنده NMDA که اخیرا کلون شده اند شامل دو خانواده می شوند که هر یک خود به زیر گروه های کوچکتری تقسیم می گردند. خانواده NMDAR1 خود از ۷ ایزوفرم مختلف (NR1a – NR1g) تشکیل می شود که همگی توسط یک ژن کد می شوند منتهی از طریق RNA, mRNA Splicing مادر به هفت mRNA مختلف تبدیل می گردد.
خصوصیات اساسی فارماکولوژیک و الکتروفیزیولوژیک کانال این واریانت های گیرنده ای خیلی شبیه یکدیگر می باشد ولی اختلافات مختصری در خصوصیات اختصاصی نظیر تمایل اتصال دارند این زیر واحدها هر کدام به یک کانال هومومریک متصل شده اند[۸۶].
خانواده گیرنده ای NMDAR2 خود شامل ۴ زیر واحد گیرنده ای است (NR2A – NR2D) که هر کدام توسط یک ژن خاص، کد می گردد. این زیر واحدها به عنوان گیرنده های تنظیمی در نظر گرفته شده اند و خودشان تشکیل کانال های هومومریک نمی دهند اما در ترکیب با زیر واحدهایی که از خانواده NMDAR1 کانالهای هترومریک بوجود می آورند. بنابراین وقتی با زیر واحدهای NMDAR2 با NMDAR1A همراه می شوند کانالهای هترومریکی تشکیل می دهند که جریانات تحریکی خیلی بزرگتری را نسبت به کانالهای هومومریک منفرد NMDAR1 بوجود می آورند. ترکیبات مختلف بین زیر واحدهای اختصاصی NMDAR2 و زیر واحد NMDAR1A تولید کمپلکس های رسپتوری و کانالی NMDA می کنند که اختلافات ظریفی را در خواص الکتروفیزیولوژیک نشان می دهند. برای مثال هترومرهای NMDAR1 و NMDAR2C یک جریان افزایشی قویتری نسبت به کمپلکس NMDAR2A , NMDAR1 نشان می دهد.
توزیع زیر واحدهای مختلف گیرنده های NMDA در سرتاسر مغز مشخص شده است. با توجه به اصالت گیرنده های NMDAR1 نسبت به گیرنده های NMDAR2 که بیشتر در حالت کمپلکس با NMDAR1 هویت یک گیرنده فونکشنال را پیدا می کند در اکثر نورون ها دانسیته بالاتری از NMDAR1 یافت می شود[۹۰]
شکل۲-۷:ساختار گیرنده NMDA [126]
.۲-۳-۶- سایت ها و عوامل تنظیم کننده
گیرنده NMDA از یک جایگاه تشخیص و یک کانال کاتیونی تشکیل شده است چنانکه انتظار می رود چندین جایگاه تنظیم کننده روی کمپلکس گیرنده – کانال وجود دارد که فعالیت های مربوط به گیرنده NMDA را بیشتر کنترل می کند.
یک جایگاه اتصالی آلوستریک در خارج کانال یونی وجود دارد که موادی نظیر گلایسین به آن متصل شده و باعث تقویت اتصال آگونیست به گیرنده می گردد. بعلاوه مشخص شده است که این جایگاه یک نقش ضروری در شروع فعالیت کانال را هم دارا می باشد.
کمپلکس گیرنده- کانال همچنین شامل یک سایت اتصالی پلی آمینی است که وقتی توسط موادی مانند اسپرمین و اسپرمیدین فعال می شود جریان تحریکی NMDA را بوسیله افزایش احتمال باز شدن کانال تقویت می کند. بخشی از این اثر با افزایش در میزان اتصال گلایسین به جایگاه مخصوص خود اعمال می گردد[۸۶].
پلی آمین اسپرمین در غلظت های بالا به یک سایت ثانویه متصل می گردد که منجر به کاهش جریان NMDA و کاهش در هدایت و یا متوسط زمان باز ماندن کانال می شود. در پتانسیل های استراحت، کانال گیرنده بصورت طبیعی بوسیله یون Mg2+ بلاک شده است و بایستی همزمان با فعال شدن گیرنده توسط آگونیست دپلاریزاسیون همزمان کافی در غشا عصبی پس سیناپسی وجود داشته باشد یعنی پتانسیل غشا بایستی از mV 70 به حدود mV 30 برسد تا بلاک Mg2+ بر طرف شده و کانال NMDA بتواند در پاسخ الکتریکی سلول شرکت کند. جایگاه Mg2+ در داخلی ترین قسمت کانال واقع شده است. میزان دپلاریزاسیون یاد شده به نسبت فعالیت گیرنده AMPA/KA و یا دیگر سیگنال های تنظیمی پس سیناپسی کنترل کننده دپلاریزاسیون وابسته است. بنابراین علاوه بر حضور آگونیست برای اینکه کانالهای NMDA را از بلاک Mg2+ خلاصی داده شود بایستی همزمان دپلاریزاسیون نورون مثلا بوسیله فعالیت گلوتامات آزاد شده از انتهای عصب مجاور بر روی گیرنده های non- NMDA صورت گیرد.
مطالعات انجام شده بر روی کمپلکس گیرنده – کانال NMDA در سطح مولکولی نشان داده است که اتصال دو مولکول گلایسین و دو مولکول گلوتامات یا سایر آگونیست های مربوطه برای فعالیت کانال ضرورت دارد[۹۰].
گیرنده NMDA همچنین بوسیله یک سایت Zn2+ مهار می شود. از طرف دیگر مشخص شده است که یک جایگاه مجزا داخل کانال وجود دارد که محل اتصال آنتاگونیست فن سیکلیدین PCP لذا به سایت PCP معروف شده است[۹۱]. مطالعات اخیر نشان می دهد یون H+ نیز اثر مهاری بر کانال اعمال می کند لذا گیرنده های NMDA در PH قلیایی فعالیت بیشتری دارند. بنابراین چندین مکانیسم مختلف برای کنترل های مثبت و منفی فعالیت کانال NMDA وجود دارد.
علاوه بر عوامل مذکور ممکن است تنظیم کننده های اندوژنوس دیگری نظیر نورواستروئیدها اسید آراشیدونیک و redox reagent نیز در تنظیم دخیل باشند.
۲-۳-۷- آگونیست و آنتاگونیست های اختصاصی
علاوه بر N – متیل D – آسپارتات، کینولینیک اسید و ایبوتنیک اسید چندین آمینو اسیدی کربوکسیلیک دیگر به عنوان آگونیست هایی که به سایت NMDA متصل می شوند معرفی گردیده اند اینها بر اساس قدرت اثر از بیشترین به کمترین عبارتند از :
L – گلوتامات، ۶- سولفو – L- سیستئین – L – هوموسیستئات – L – آسپارتات، هوموکینولینات، L- هوموسیستئین سولفینات ، L – سیستئین سولفینات ، L- سرین – O – سولفات، L- سیستئات و کینولینات.
چندین آگونیست که از نظر Conformation محدود شده اند معرفی گردیده اند که تعدادی از آنها NMDA قویتر هستند. برای مثال یکی از قویترین آگونیست های موجود یک ترکیب rigid بنام ACBD (1-aminocyclobutane-cis-1,3-dicarboxylic) است که ترکیبی طبیعی حاصل از دانه ی گیاه Genus Atelia می باشد. این حقیقت که این ترکیب یک آنالوگ انتخابی و قوی برای گیرنده های NMDA است. با این پیشنهاد موافقت دارد که کاهش conformational flexibility انتخابی بودن را افزایش می دهد.
در همین جا شایان ذکر است که ترکیب trans – ACBD چنانکه ذکر شد با تفاوت کربن در حلقه خود اثر انتخابی بر گیرنده های کاملا متفاوت متابوتروپیک دارد. آنتاگونیست های رسپتور NMDA به سه دسته تقسیم می شوند[۹۲].
۱- آنتاگونیست های رقابتی مانند D , DAP7 , DAPS – آلفا – آمینو آدیپات CPPene , CPP که کربن های میانی آنها بصورت rigidified محکم شده اند ( نظیر یک کانفورمیشن حلقوی) منجر به سنتز ترکیبات قویتر از AP7 , APS شده اند نظیر CGP .
۲- چندین آنتاگونیست غیر رقابتی معرفی شده اند که به یک سایت اختصاصی داخل خود کانال متصل می شوند[۹۰] (PCP , MK 801). اتصال به بخش داخلی کانال بستگی به حالت کانال یونی از نظر باز و بسته بودن دارد و ترکیبات آنتاگونیستی نظیر PCP – like , PCP فقط وقتی کانال باز است می توانند بدان متصل شوند لذا در حضور آگونیست های NMDA امکان اتصال آنتاگونیست های مذکور افزایش می یابد.
در عین حال باید توجه شود که ترکیبات PCP – like , PCP بصورت انتخابی فقط به سایت رسپتوری PCP متصل نمی شوند و روی سایر گیرنده های یونوتروپیک و متابوتروپیک و گیرنده های سیگمای مغزی نیز ممکن است اثر نمایند ( البته با ۱/۰ قدرت اثر آن روی سایت PCP رسپتور NMDA ) کلا با توجه به توضیحات ذکر شده آنتاگونیست های PCP و شبه PCP بنام Open Channel blockers خوانده می شوند. اخیرا آنتاگونیست جدیدی بنام ifenprodil معرفی شده که با توجه به نفوذپذیری زیاد قادر است کانال های بسته را نیز بلاک کند (Closed Channel blocker) .
۳- یک سری از آنتاگونیست های غیر رقابتی هستند که به سایت گلایسینی وصل می شوند نظیر ۵و۷ – دی کلروکی نورنات[۹۳].
فصل سوم :مواد و روش ها
۳-۱-نوع مطالعه و جمعیت مورد مطالعه
مطالعه از نوع تجربی و در آزمایشگاه گروه فارماکولوژی دانشگاه تهران بر روی موش های صحرایی ازجنس نر و نژاد Wistar در محدرده وزنی ۲۳۰ تا ۲۵۰ انجام گرفته است که همگی در حیوان خانه بخش فارماکولوژی تکثیر یافته بودند .موش ها در قفس های پلاستیکی مخصوص در شرایط استانداردc °۲±۲۲با چرخه روشنایی /خاموشی به صورتh 12/ 12 نگهداری می شدند.نور دهی از ساعت هفت صبح شروع می شد و غذا و آب کافی در اختیار موشها قرار داشت. هر یک از حیوانات تنها یک بار مورد آزمایش قرار میگرفتند و پس از آزمانش حذف می شدند.
۳-۲- مکان انجام آزمایش
محل انجام آزمایشات بخش فارماکولوژی دانشکده پزشکی بود. که شامل سه بخش اصلی حیوانخانه ،اتاق جراحی و اتاق تست می شد که هر کدام شرایط مخصوص به خود را داشت.
۳-۲-۱-حیوان خانه (Animal house)