وبلاگ

B 104

۲۶۰۱۰۳

۳۵۱۲۱۹۶

۳۶m

 

B 105

۲۵۹۷۷۴

۳۵۱۲۰۹۶

۴۱m

 

B 106

۲۵۸۴۴۳

۳۵۰۹۷۴۵

۳۹m

 

B 107

۲۵۸۲۵۲

۳۵۰۸۵۳۹

۳۴m

 

B 108

۲۵۸۲۱۰

۳۵۰۸۵۱۲

۳۹m

 

B109

۲۵۸۲۰۵

۳۵۰۸۵۰۶

۴۱m

 

 

شکل۱-۳ عکس هوایی نمونه های والدی (منطقه‌ی غرب کرخه)
۲-۲-۳ استخراج DNA ژنومی
جایگاه DNA^[68]ی ژنومی درون سلول است و گیاهان برخلاف جانوران دارای دیواره‌ی سلولی محکمی هستند که به منظور خارج ساختن DNA باید این دیواره و غشای سلولی را از بین برد. هر روش مکانیکی که باعث شکستن دیواره و غشای سلولی بدون تجزیه‌ی DNA شود و دسترسی به مواد سلولی را افزایش دهد مورد استفاده قرار می‌گیرد. بدین منظور از نیتروژن مایع استفاده شد که علاوه‌ بر شکستن دیواره‌ی سلولی، آنزبم‌ها و نوکلئاز‌ها را غیرفعال نگه می‌دارد، از طرف دیگر افزودن بافر CTAB^[69] نیز سبب حذف غشای سلولی می‌شود. بافر CTAB ترکیبی از (۸Tris-HCl (pH=، Na₂EDTA^[70](PH=8) ، NaCl، CTAB و ۲-مرکاپتواتانول^[۷۱] بود (جدول ۲-۳).
غشاهای بیولوژیکی ساختاری کلی دارند که تشکیل شده‌اند از مولکول‌های لیپید به صورت یک دو لایه‌ی پایدار و پروتئین که توسط پیوند‌‌های غیرکووالانت کنار یکدیگر نگاه داشته شده‌اند. از آن‌جایی‌که ترکیب لیپید و دترجنت CTAB به یکدیگر شباهت دارند ، اجزاء CTAB موجود در بافر استخراج قادر به ایجاد پیوند و حل لیپیدهای تشکیل دهنده‌ی غشاء سلولی و هسته می‌باشند. ماده‌ی ۲-مرکاپتواتانول یکی از اجزاء بافر استخراج است که بصورت تازه به نمونه اضافه می‌شود و در شکستن پل‌های دی‌سولفیدی پروتئین‌ها و دناتوره شدن پروتئین‌های غشاء و سیتوزول موثر است، بدین صورت غشاء تجزیه و DNAی ژنومی آزاد می شود. در غلظت خاصی از نمک NaCl دترجنت ترکیبی نامحلول با نوکلئیک اسیدها ایجاد می‌کند. DNA به دلیل دارا بودن بار منفی به بار مثبتی که NaCl ایجاد می‌کند جذب شده و تجمع می‌یابد.
EDTA موجود در بافر استخراج یک عامل کلاته کننده است که به Mg⁺² موجود در دیواره‌ی سلولی متصل گشته و باعث بی‌ثباتی دیواره‌ی سلولی می‌شود، همچنین یون منیزیم یک کوفاکتور برای DNase می‌باشد که بااتصال Mg⁺² به EDTA فعالیت DNase موجود کاهش می‌یابد. بافر (۸Tris-HCl (pH= به محلول ظرفیت بافری می‌دهد تا DNA در pH های بالاتر و یا پایین‌تر از حد مجاز استخراج، آسیب ‌نبیند.

در مرحلۀ بعد از اضافه کردن بافر استخراج، محلول کلروفرم-ایزوآمیل‌الکل^[۷۲] به نسبت ۲۴ به ۱ اضافه می‌شود. کلروفرم جداسازی فاز مایع و ارگانیک را تسهیل نموده و با واسرشته کردن پروتئین‌ها و از بین بردن لیپید‌ها باعث جدا شدن ماده‌ی ژنتیکی می‌شود. به‌منظور رسوب‌دهی DNA از ایزوپروپانول سرد استفاده می‌شود که باعث از بین رفتن ترکیبات فنولی باقی‌مانده و یون‌های معدنی نیز می‌شود.
جدول ۲-۳ ترکیبات بافر استخراج CTAB