وبلاگ

۵

سیستئین اسیدی (۸۲/۳) و سدیم سولفید (۸۳/۰)

RAII

۸/۶

۶

سیستئین اسیدی (۵۳/۲) و سدیم سولفید (۶۷/۱)

RAIII

۸/۶

تاثیر فشار اولیه گاز سنتز در بیوراکتورهای ناپیوسته
رشد سلول میکروبی و تولید محصول توسط میکروارگانیزم در فرایند تخمیرگاز سنتز می تواند به شدت تحت تاثیر فشار جزئی اجزای گاز باشد زیرا آنزیمهایی که در مسیر متابولیکی ارگانیزم دخالت دارند به میزان قرار گرفتن در معرض سوبسترا حساس هستند [۱۱۳]. برای بررسی این پارامتر مهم، یک سری آزمایش با تغییر فشار گاز سنتز داخل سرم باتل انجام گرفت. بدین منظور، پس از آماده سازی ۶ محیط کشت در سرم باتل، فشار گاز سنتز در داخل سرم باتل ها از ۲/۰ تا ۵/۱ اتمسفر (فشار نسبی) تغییر داده شد. بدین ترتیب که پس از عبور گاز سنتز از داخل سرم باتل به مدت ۰/۱ دقیقه، سوزن خروجی برداشته شده و فشار گاز داخل باتل از روی فشار سنج رگلاتور تا حد مطلوب تنظیم گردید. سپس تمام باتل ها با سلولهای فعالی که از بیوراکتور گرفته شده بودند تلقیح گردیدند. فرایند انکوباسیون و نمونه برداری از باتل ها در مدت زمان ۳۶ ساعت انجام شد.

آزمایشهای پیوسته^[۲۴۸] تخمیر گاز سنتز
آزمایشهای پیوسته تخمیر گاز سنتز که با کنترل پارامترهای عملیاتی همراه بود در بیوراکتور ۲ لیتری (Infors، سوئیس) انجام گرفت. شکل ۳-۱ شماتیکی از سیستم مورد استفاده برای انجام آزمایشهای پیوسته تخمیر گاز سنتز را نشان می دهد.
شکل ‏۳‑۱: نمایی شماتیک از سیستم پیوسته در فرایند تخمیر گاز سنتز
ترکیب محیط کشت مورد استفاده در بیوراکتور عینا همانند آزمایشهای ناپیوسته و مطابق جدول ۳-۱ بود. در اولین مرحله استفاده از بیوراکتور، ۵/۱ لیتر محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) تهیه و در داخل بیوراکتور ریخته شد. سپس بیوراکتور حاوی محیط کشت به همراه تمام تجهیزات، لوله ها و پمپ های مربوطه اتوکلاو شدند. پس از استریلیزاسیون، از جریان گاز نیتروژنی (پس از عبور از فیلتر) که از طریق اسپارجر وارد بیوراکتور می شد برای خنک کردن محیط کشت و ایجاد شرایط بی هوازی استفاده گردید. پس از آنکه دمای محیط کشت تا حدود ۴۵ درجه سانتیگراد کاهش یافت، عوامل کاهنده که همانند قبل در سرم باتل تهیه و استریل شده بود به محیط کشت اضافه گردید. دمای بیوراکتور در ۳۷ درجه سانتیگراد، pH محیط کشت در ۹/۵ و دور همزن در ۳۵۰ (rpm) تنظیم شد. برای تنظیم pH محیط کشت، از محلول اسید کلریدریک و هیدروکسید سدیم ۰/۱ مولار استریل شده استفاده گردید. پس از تنظیم کنترل کننده ها، جریان گاز نیتروژن قطع شده و گاز سنتز پس از عبور از دستگاه کنترل کننده جریان^[۲۴۹] ۵۸۵۰E) model Brooks,، امریکا) با شدت جریان معین از طریق اسپارجر وارد محیط کشت شد. شدت جریان گاز ورودی به بیوراکتور توسط ماژولی ۰۱۵۲E) model Brooks,) که دستگاه کنترل کننده جریان به آن متصل بود تنظیم شد. جریان گاز خروجی از بیوراکتور از طریق لوله کشیهای انجام شده برای این منظور به خارج از محیط آزمایشگاه فرستاده شد.
برای تلقیح محیط کشت، از باکتریهای در حال رشد روی فروکتوز که در سرم باتل رشد داده شده بودند استفاده گردید و محیط کشت با ۱۰% حجمی از این سلولها تلقیح شد. در چند روز اول آزمایش برای رسیدن به دانسیته سلولی قابل قبول، بیوراکتور در حالت نیمه پیوسته مورد بهره برداری قرار گرفت بدین ترتیب که فاز مایع (محیط کشت) ثابت بوده و فاز گاز به صورت پیوسته در جریان بود. همچنین، pH محیط کشت روی ۹/۵ ثابت نگه داشته شد تا سلولها در فاز رشد باقی بمانند.
پس از گذشت ۴ روز که دانسیته سلولی در محیط کشت به حد مطلوبی رسید، سیستم از حالت نیمه پیوسته به پیوسته تبدیل شد. برای این منظور، حجم ۰/۱ لیتر محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) در باتل پیرکس (Schott) در بسته تهیه و استریل شد. در روی درب باتل یک ورودی و یک خروجی وجود داشت که از طریق آنها نیتروژن پس از عبور از فیلتر وارد محیط کشت شده و آن را خنک می کرد. پس از خنک شدن محیط کشت و در حالی که جریان نیتروژن همچنان وجود داشت، عوامل کاهنده به محیط کشت اضافه شده و pH محیط روی ۹/۵ تنظیم گردید. سپس، جریان گاز نیتروژن قطع شده و جریان پیوسته محیط کشت به درون بیوراکتور با بهره گرفتن از یکی از پمپهای بیوراکتور آغاز گردید. لازم به ذکر است که پیش از این پمپ بیوراکتور برای تنظیم شدت جریان محیط کشت به درون بیوراکتور کالیبره شد. به منظور جلوگیری از ورود اکسیژن و هرگونه آلودگی به درون محیط کشت داخل باتل، کیسه کوچکی موسوم به تدلار بگ^[۲۵۰] (Cole-Parmer) از گاز نیتروژن پر شده و به لوله خروجی متصل گردید که نمایی از آن در تصویر ۳-۶ نشان داده شده است.
تصویر ‏۳‑۶: محیط کشت استریل همراه با تدلار بگ و جریان ورودی به بیوراکتور
برای جریان خروجی از بیوراکتور نیز از یکی از چهار پمپ بیوراکتور استفاده گردید. جریان خروجی وارد باتلی مشابه باتل حاوی محیط کشت می شد. برای کاهش امکان آلوده شدن محیط کشت در بیوراکتور، باتل و لوله های خروجی نیز هر روز استریل می شدند. تصویر ۳-۷ نمایی از سیستم پیوسته برای تخمیر گاز سنتز توسط باکتری لانگالی را نشان می دهد.
تصویر ‏۳‑۷: نمایی از سیسستم پیوسته در فرایند تخمیر گاز سنتز توسط باکتری لانگالی
تاثیر نرخ رقیق سازی^[۲۵۱]
به منظور بررسی تاثیر نرخ رقیق سازی روی عملکرد باکتری در فرایند تخمیر پیوسته گاز سنتز، شدت جریان فاز مایع (محیط کشت) از ۳/۰ میلی لیتر بر دقیقه (۰۱۲/۰=D بر ساعت) تا ۷۵/۰ میلی لیتر بر دقیقه (۰۳۰/۰=D بر ساعت) تغییر داده شد، در حالی که شدت جریان گاز سنتز و دور همزن ثابت نگه داشته شد. هر ۱۲ ساعت از فاز گاز و مایع نمونه برداری شد و نمونه ها مورد آنالیز قرار گرفتند تا دانسته سلولی، میزان مصرف سوبسترای گازی و اتانول و استات تولید شده در محیط کشت تعیین شود.
تاثیر شدت جریان گاز سنتز و دور همزن
برای مطالعه تاثیر شدت جریان گاز سنتز و دور همزن روی عملکرد سلولها در محیط کشت و ضریب انتقال جرم در فرایند تخمیر گاز سنتز، شدت جریان گاز از ۰/۴ تا ۰/۱۲ میلی لیتر در دقیقه تغییر داده شد و در هر شدت جریان گاز، دور همزن از ۵۰۰-۲۰۰ rpm افزایش داده شد. همان طور که قبلا اشاره شد برای تنظیم شدت جریان گاز از دستگاه کنترل کننده شدت جریان گاز استفاده گردید. در بررسی این پارامتر عملیاتی، سایر عوامل همچون شدت جریان مایع (نرخ رقیق سازی) و دور همزن ثابت نگه داشته شدند. هر ۱۲ ساعت از فاز گاز و مایع در بیوراکتور نمونه برداری شد و نمونه ها مورد آنالیز قرار گرفتند تا شدت جریان بهینه تعیین شود.
آنالیز نتایج
اندازه گیری دانسیته سلولی
برای اندازه گیری دانسیته سلول در محیط کشت، از منحنی کالیبراسیون دانسیته سلولی بر حسب شدت جذب نور استفاده می شود. برای به دست آوردن این منحنی، محیط کشتی حاوی ۰/۵ گرم در لیتر فروکتوز تهیه گردید. همانند قبل، محلول فروکتوز و عوامل کاهنده در باتل های جداگانه تهیه و استریل شدند و سپس به محیط کشت اصلی اضافه گردیدند. پس از آن، pH محیط کشت با بهره گرفتن از محلول اسید کلریدریک یا هیدروکسید سدیم ۰/۱ مولار روی ۹/۵ تنظیم شد. این محیط کشت (۵۰ میلی لیتر) با ۰/۵% حجمی از کشت بذر^[۲۵۲] (۵/۲ میلی لیتر) تلقیح گردید. محیط کشت تلقیح شده در شیکر انکوباتور که در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و دور۱۵۰(rpm) تنظیم شده بود، قرار داده شد. پس از گذشت زمان حدود ۲۰ ساعت که محیط کشت در اثر رشد باکتری کدر شده بود، ۱۰ نمونه محلول از محیط کشت تهیه گردید. بدین ترتیب که در ۱۰ لوله آزمایش، از حجم ۰/۱ تا ۱۰ میلی لیتر محیط کشتی که باکتری در آن رشد کرده بود ریخته شد. حجم محلول تمام لوله های آزمایش با افزودن ۰/۹ تا صفر (لوله دهم حاوی محیط کشت خالص بود) میلی لیتر آب مقطر به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. بدین ترتیب، ده غلظت مختلف از محیط کشت باکتری لانگالی حاصل گردید.
برای محاسبه وزن خشک سلول، از فیلتر غشایی ۴۵/۰ میکرون ((Sartorius Nylon membrane با قطر ۱۳ میلی متر استفاده گردید. ابتدا، ده فیلتر غشایی در آون (Memmert، آلمان) در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد برای مدت ۱۶ ساعت خشک شدند. سپس فیلترها با ترازوی دیجیتالی (Mettler Toledo، سوئیس) دقیق با دقت پنج رقم بعد از اعشار وزن گردیده و وزن هر فیلتر یادداشت شد. سپس فیلتر غشایی در داخل نگهدارنده فیلتر^[۲۵۳]((Advantec, MFS, Inc. قرار داده شد. از هر لوله آزمایش یک میلی لیتر محلول توسط سرنگ برداشته شد و به درون نگهدارنده فیلتر تزریق گردید. بدین ترتیب، از ده فیلتر برای فیلتر کردن ده محلول محیط کشت استفاده گردید. سپس، فیلترها مجددا در داخل آون خشک شدند و وزن نهایی آنها اندازه گیری شد. از تفاضل وزن نهایی و اولیه فیلتر و با در نظر گرفتن حجم ۰/۱ میلی لیتر محلولی که فیلتر شده بود دانسیته سلولی این ده نمونه بر حسب گرم بر لیتر محاسبه گردید.
برای به دست آوردن شدت جذب این ده نمونه از محیط کشت، مقداری از هر نمونه داخل سل^[۲۵۴] دستگاه اسپکتروفتومتر (Agilent technology, Cary 60 UV-Vis، امریکا) ریخته شد و جذب هر نمونه در دستگاه در طول موج ۵۸۰ نانومترخوانده شد. از یک نمونه محیط کشت بدون باکتری به عنوان نمونه شاهد برای صفر کردن شدت جذب استفاده گردید. سپس منحنی دانسیته سلولی بر حسب شدت جذب ترسیم گردیده و به عنوان منحنی کالیبراسیون برای اندازه گیری دانسیته سلولی در آزمایشها مورد استفاده قرار گرفت. منحنی کالیبراسیون به دست آمده در شکل ۳-۲ نشان داده شده است.
شکل ‏۳‑۲: منحنی کالیبراسیون برای محاسبه دانسیته سلولی باکتری لانگالی
آنالیز فروکتوز و گلوکز در محیط کشت
برای اندازه گیری غلظت فروکتوز و گلوکز در محیط کشت از روش رنگ سنجی استفاده گردید. در این روش که برای تشخیص قندهای کاهنده^[۲۵۵] متداول است، از معرف DNS استفاده می شود. برای تهیه این معرف، مقدار ۱۰ گرم دی نیتروسالیسیلیک اسید^[۲۵۶] (DNS) در ۲۰۰ میلی لیتر محلول هیدروکسید سدیم ۲ مولار حل گردیده و جوشانده شد. به صورت همزمان، محلول دیگری با حل کردن ۳۰۰ گرم تاراتارات سدیم پتاسیم^[۲۵۷] در ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه گردیده و جوشانده شد. بلافاصله، این محلول به محلول در حال جوش DNS اضافه گردید و حجم محلول با افزودن آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده شد. از محلول حاصل به عنوان معرف در تشخیص غلظت فروکتوز و گلوکز در محیط کشت بر اساس منحنی کالیبراسیون استفاده شد.
برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون برای فروکتوز، محیط کشتی (medium) با غلظت ۰/۱ گرم بر لیتر فروکتوز تهیه گردید. در ده لوله آزمایش مقدار ۰/۱ تا ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت ریخته شد و سپس ۰/۹ تا صفر میلی لیتر آب مقطر به لوله های آزمایش اضافه گردید تا حجم نهایی در هر لوله ۰/۱۰ میلی لیتر شود. بدین ترتیب محلولهایی با غلظت ۱/۰ تا ۰/۱ گرم بر لیتر فروکتوز حاصل گردید. از هر محلول، ۰/۱ میلی لیتر نمونه برداشته شد و در ده لوله آزمایش جدید ریخته شد. سپس، به هر لوله ۰/۱ میلی لیتر معرف DNS اضافه گردید. لوله ها در بشری حاوی آب جوش قرار داده شده و به مدت ۱۵ دقیقه جوشانده شدند تا واکنش بین قند و معرف تکمیل شده و رنگ نارنجی پر رنگ (بر اساس میزان قند) حاصل گردد. پس از آن به منظور متوقف کردن واکنش، لوله های آزمایش در داخل آب و یخ قرار داده شدند. به هر لوله آزمایش ۸ میلی لیتر آب مقطر اضافه شد تا حجم نهایی ۱۰ میلی لیتر شود. برای به دست آوردن شدت جذب نور این ده نمونه محلول قندی، مقداری از هر نمونه داخل سل دستگاه اسپکتروفتومتر (Agilent technology, Cary 60 UV-Vis، امریکا) ریخته شد و جذب هر نمونه در دستگاه در طول موج ۵۴۰ نانومترخوانده شد. برای تهیه نمونه شاهد، از محیط کشت بدون قند استفاده گردید و سایر مراحل آزمایش همانند نمونه های حاوی قند بود. منحنی کالیبراسیون حاصل شده برای فروکتوز در شکل ۳-۳ نشان داده شده است.
شکل ‏۳‑۳: منحنی کالیبراسیون برای فروکتوز
برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون برای گلوکز، محیط کشتی حاوی ۰/۱ گرم بر لیتر گلوکز تهیه گردیده و سایر مراحل همانند آزمایش فروکتوز عینا تکرار گردید. شکل ۳-۴ منحنی کالیبراسیون به دست آمده برای گلوکز را نشان می دهد.
شکل ‏۳‑۴ : منحنی کالیبراسیون برای گلوکز
آنالیز نمونه های مایع برای اتانول و استات
برای تعیین غلظت اتانول و استات و گاهی استون در فاز مایع از آنالیز کروماتوگرافی گازی استفاده گردید. دستگاه کروماتوگراف گازی (Agilent, 5890 series II) مجهز به آشکارساز^[۲۵۸]FID بوده و به همین دلیل استفاده از کپسولهای گاز هیدروژن و هوا برای تولید شعله ضروری بود. از یک ستون کروماتوگرافی پرشده^[۲۵۹] (Carbopack B-DA/4% Carbowax 20M, mesh 80/120) Supelco)، امریکا) برای تشخیص محصولات فرایند تخمیر گاز سنتز استفاده گردید. گاز حامل^[۲۶۰] GC، هلیم با شدت جریان ۳۰ میلی لیتر در دقیقه بود. دمای آون برای مدت ۲ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتیگراد نگه داشته شده و سپس با نرخ ۱۰ درجه سانتیگراد در دقیقه تا ۱۷۵درجه سانتیگراد افزایش داده شد و مدت ۱ دقیقه نیز در این دما نگه داشته شد. دمای محل تزریق^[۲۶۱] و آشکارساز ۲۲۵ درجه سانتیگراد بود.
برای آماده سازی نمونه های مایع، ۵/۱ میلی لیتر از محیط کشت نمونه برداری شده در ویالهای پلاستیکی^[۲۶۲] کوچک ریخته شده و در میکروسانتریفیوژ (Profuge 6K، کره) به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ گردید. پس از جداسازی سلولها، ۵/۰ میلی لیتر از مایع شفاف بالایی برداشته شد. سپس، نمونه ها با افزودن ۱۵ میکرولیتر اسید فرمیک ۹۸% (مرک) به وسیله میکروپیپت (Favorit) اسیدی شدند. همچنین ۱۵ میکرولیتر از محلول ۵/۰% حجمی ۲-پنتانون^[۲۶۳] (فیشر^[۲۶۴]) که به عنوان استاندارد داخلی استفاده می شد به نمونه ها اضافه گردید. بدین ترتیب نمونه ها برای تزریق به GC آماده شدند. ۰/۲ میکرولیتر از نمونه توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری (SGE، استرالیا) برداشته شده و به GC تزریق گردید. از مقایسه مونوگرام حاصل شده برای هر نمونه با مونوگرام مربوط به نمونه استاندارد و انجام محاسبات مربوطه، غلظت اتانول و استات در نمونه تعیین گردید. نمونه استاندارد محلولی حاوی اتانول، استات و استون با غلظتهای ۰/۱ گرم در لیتر بود که همانند سایر نمونه ها اسیدی شده و استاندارد داخلی به آن اضافه شده بود. نمونه هایی از مونوگرامهای حاصله و محاسبات مربوطه در پیوست الف ارائه شده است.
آنالیز نمونه های گاز
برای تعیین میزان گاز مصرف شده در فرایند تخمیر گاز سنتز از آنالیز کروماتوگرافی گازی استفاده گردید. بدین منظور از دستگاه کروماتوگراف گازی (Perkin Elmer, Autosystem XL) با آشکارساز TCD استفاده شد. ستون کروماتوگرافی مورد استفاده یک ستون پرشده۱۵ ft × ۱/۸ in., mesh 100/120) Carboxene 1000,) Supelco)، امریکا) و گاز حامل GC، هلیم با شدت جریان ۳۰ میلی لیتر در دقیقه بود. دمای آون برای مدت ۳ دقیقه در ۵۰ درجه سانتیگراد نگه داشته شد و سپس با نرخ ۲۰ درجه سانتیگراد در دقیقه تا ۱۸۰ درجه سانتیگراد افزایش داده شد و در این دما به مدت ۵/۲ دقیقه ثابت نگه داشته شد. دمای محل تزریق و آشکارساز به ترتیب ۱۵۰ و ۲۲۰ درجه سانتیگراد بود.
برای آنالیز نمونه های گاز ۳/۰ میلی لیتر از نمونه گازی (از فضای بالای سرم باتل یا بیوراکتور) توسط سرنگ ۰/۱ میلی لیتری (Hamilton، امریکا) کشیده شده و به GC تزریق گردید. محاسبات مربوط به تعیین درصد اجزای گاز توسط نرم افزار TotalChrom Workstation Version 6.3.1 (Perkin Elmer، امریکا) انجام شد. محاسبات مربوط به تعیین درصد اجزای گاز سنتز با توجه به نمونه استاندارد به همراه چند مونوگرام در پیوست ب آورده شده است.
مدلهای کینتیکی و روش به دست آوردن آنها
کینتیک رشد سلول
ساده ترین مدلی که برای توصیف رشد سلول در محیط کشت ناپیوسته ارائه شده است مدل متهیوس^[۲۶۵] است که به صورت زیر بیان می شود [۱۱۶]: