pH 7.5± ۰.۲
۳-۲-۴-۱-۱- طرز تهیه
برای تهیه این محیط کشت، از پودر آماده شرکت مرک که استاندارد تهیه آن ۳۴ گرم در لیتر بود، استفاده شد. ابتدا حجم آب مقطر لازم به کمک مزور اندازه گیری شد و در یک ارلن با حجم مشخص ریخته شد. سپس پودر محیط کشت به کمک ترازوی دیجیتال وزن شد و به آن اضافه شد. پس از هم زدن محلول، ارلن روی شعله قرار داده شد تا زمانیکه محلول کاملاً شفاف و یکنواخت بدست آمد. سپس به کمک مقداری پنبه و فویل آلمینیومی، سر ارلن بسته شد و جهت سترون سازی در اتوکلاو قرار گرفت. سپس محیط مورد نظر در شرایط استریل و کنار شعله، پس از رسیدن دمای ارلن به حدود ۴۰ درجه سانتی گراد، به داخل پلیتهای استریل یک بار مصرف انتقال داده شد و سپس تا زمان استفاده درون یخچال در ۴+ درجه سانتی گراد نگهداری شد. پلیتهای مورد نظر هر کدام ۸ و ۱۰ سانتیمتر قطر داشته و ۲۵ میلیلیتر از محیط MHA در آنها ریخته شد.
۳-۲-۴-۲- محیط کشت مولر هینتون براث
از این محیط به طور عمومی، جهت بررسی نتایج MIC و MBC استفاده می شود.
مواد متشکله این محیط عبارتند از:
Acid casein pepton (H) 17.50g
Cornstarch 1.50g
Beef infusion 2.00g
pH 7.5± ۰.۲
۳-۲-۴-۲-۱- طرز تهیه
برای تهیه این محیط کشت، از پودر آماده شرکت کیولب که استاندارد تهیه آن ۲۱ گرم در لیتر بود، استفاده شد. ۲۱ گرم از محیط کشت توسط ترازوی دیجیتال وزن شد و با یک لیتر آب مقطر مخلوط شد. سپس ارلن روی حرارت گذاشته شد و محلولی کاملاً شفاف به دست آمد. سپس درب آن را توسط پنبه و فویل بسته شد و در دستگاه اتوکلاو قرار داده و استریل گردید. این محیط از لحاظ اجزای تشکیل دهنده بسیار شبیه MHA است اما به دلیل عدم داشتن آگار، از این محیط به عنوان حلال مایع استفاده می شود.
۳-۲-۵- سرم فیزیولوژی
برای تهیه نرمال سالین مقدار ۹/۰ گرم Nacl در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر کاملاً حل شد و سپس درب آن بسته شد و جهت استریل شدن اتوکلاو گردید.
۳-۲-۶- روش تهیه استاندارد نیم مک فارلند
۳-۲-۶-۱- مواد و وسایل مورد نیاز
۱- اسید سولفوریک ۹۸%
۲-پودر کلرور باریم
۳-مزور ۱۰۰ سی سی
۴-آب مقطر
۵- لوله آزمایش
۶- پیپت
۳-۲-۶-۲- روش کار
ابتدا از اسید سولفوریک ۹۸%، اسید سولفوریک ۱% تهیه گردید. بدین ترتیب که ۹۹ میلیلیتر آب مقطر، با یک میلیلیتر اسید سولفوریک ۹۸% مخلوط شد (باید دقت شود که به علت گرمازا بودن واکنش اسید به آب اضافه گردد)، سپس ۱۷۵/۱ گرم از پودر کلرور باریوم با ترازوی دیجیتال وزن شد و سپس با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رسانده، بدین ترتیب کلرور باریوم ۱۷۵/۱% تهیه گردید. سپس ۵/۹۹ میلیلیتر از اسید سولفوریک ۱% با ۵/۰ میلیلیتر کلرور باریوم مخلوط شد. در اثر رسوب BaSO4 کدورتی در لوله ظاهر می شود که این کدورت همان استاندارد ۵/۰ مک فارلند است. سوسپانسیون ۵/۰ مک فارلند nm625 جذب ۱/۰-۰۸/۰ دارد.
۳-۲-۷- سوسپانسیون میکروبی
ابتدا در مورد تمام باکتری ها عمل رقیقسازی انجام گرفت. ۲۴ ساعت قبل از انجام هر مرحله از آزمایش و با بهره گرفتن از محیطهای کشت ذخیره مبادرت به تهیه کشت تازهای شد که به آن کشت ۲۴ ساعته گویند. برای این کار توسط لوب استریل در کنار شعله و محیط آسپتیک، از کشتهای ذخیرهای، نمونهای برداشته شد و به لوله آزمایش حاوی سرم فیزیولوژی اضافه شد و سوسپانسیون میکروبی تهیه گردید. این سوسپانسیون با استاندارد نیم مک فارلند مقایسه شد. این مقایسه چشمی در نور کافی انجام گرفت. سوسپانسیون حاصله ۱۰۸×۵/۱ بود. در این زمان باکتری ها فعال و آماده برای کشت بودند.
۳-۲-۸- آماده سازی کشتهای میکروبی
در کنار شعله و بر روی میز کار ضد عفونی شده، توسط سوآب استریل، از سوسپانسیون حاوی باکتری که معادل ۵/۰ مک فارلند ساخته شده برداشته شد و با تماس دادن سوآب به لبه داخلی لوله، اضافه شیرابه میکروبی جدا شد و سپس سوآب آغشته به باکتری بر روی پلیتی که قبلاً نام باکتری روی بدنه آن یادداشت گردیده بود، به صورت خطوط موازی در سه جهت (عمودی، افقی، مورب) بر هم کشیده شد، به گونه ای که تمام سطح پلیت از یک لایه باکتری به طور یکنواخت پوشیده گردید. در این مراحل باید مراقب بود که شیرابه میکروبی به خارج ریخته نشود و آلودگی در محیط ایجاد ننماید. سپس توسط پیپت پاستور استریل بر روی محیط کشت، چاهک ایجاد شد.
۳-۲-۹- آماده سازی عصاره متانولی با غلظتهای مختلف
از عصاره متانولی آویشن شیرازی mg200 توسط ترازوی آنالیتیکال وزن گردید. به آن ۲ میلیلیتر حلال ۱۰% DMSO، اضافه شد و توسط دستگاه ورتکس کاملاً عصاره گیاه در آن حل شد و غلظت mg/ml100 به دست آمد. سپس ۱ میلیلیتر از این محلول برداشته شد و به لوله آزمایش بعدی منتقل شد. ۱ میلیلیتر از حلال ۱۰%DMSO به آن اضافه گردید و توسط ورتکس کاملاً حل شد و غلظت mg/ml50 بدست آمد. این روند همینطور ادامه داده شد. از آخرین لوله آزمایش ۱ میلیلیتر برداشته و دور ریخته شد. غلظتهایی که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفتند، غلظتهای mg/ml100، mg/ml50، mg/ml 25، mg/ml 5/12، mg/ml۲۵/۶، mg/ml 125/3، mg/ml 56/1 و mg/ml 78/0 بود، که حجم هر یک در لوله آزمایش ۱ میلیلیتر بود.
۳-۲-۱۰- آماده سازی اسانس با غلظتهای مختلف
از اسانس استوک به میزان ۴/۰ سی سی بر داشته شد (که برابر با ۴۰۰ میکرولیتر میباشد) و ۲ میلیلیتر حلال۱۰% DMSO به آن اضافه شد و توسط دستگاه ورتکس کاملاً مخلوط گردید. وزن ۱سی سی اسانس تقریباً برابر با ۱۰۰۰ میلیگرم میباشد. بنابراین غلظت به دست آمده mg/ml 200 بود. ۱میلیلیتر از این محلول برداشته شد و با ۱ میلیلیتر حلال مخلوط شد و همنطور این روند ادامه داده شد تا غلظتهای مورد نظرمان بدست آمد. از آخرین لوله آزمایش نیز ۱ میلیلیتر دور ریخته شد. غلظتهایی که بدست آمد mg/ml200، mg/ml100، mg/ml50، mg/ml25، mg/ml 5/12 mg/ml, 25/6، mg/ml125/3، mg/ml56/1 و mg/ml 78/0 بود، که حجم نهایی در هر لوله آزمایش ۱ میلیلیتر بود.
۳-۲-۱۱- مشخصات محلول کلوئیدی نانو ذرات نقره
در این تحقیق از کلوئید نانو ذرات نقره محصول شرکت نانو لوتوس پاسارگاد با نام تجاری کلوئید نقره LNP-CS استفاده شد که به روش شیمیایی سنتز شده است. اندازه ذرات ۴۰ نانومتر بوده و غلظت استوک آن ppm8000 بود.
شکل ۳-۱- تصویر میکروسکوپ الکترونی از نانو ذرات نقره محصول نانو لوتوس پاسارگاد
۳-۲-۱۲- آماده سازی محلول نانو ذرات نقره با غلظتهای مختلف
با توجه به اینکه محلول استوک نانو ذرات نقره آماده بود. برای تهیه غلظتهای مختلف ۹ لوله آزمایش استریل آماده شد. و به تمام لولهها ۱ میلیلیتر آب مقطر استریل دیونیزه که حلال محلول نانو ذرات نقره میباشد، اضافه شد. سپس از محلول استوک به میزان ۱ میلی لیتر برداشته و به لوله اول اضافه شد و کاملا با دستگاه ورتکس مخلوط شد. غلظت لوله اول µg/ml 4000 بود. ۱ میلیلیتر از این محلول برداشته و به لوله آزمایش بعدی اضافه شد. کاملا مخلوط گردید و همین روند تا لوله آزمایش آخر ادامه داده شد و از آن ۱ میلیلیتر دور ریخته شد.
غلظتهای بدست آمده به ترتیب عبارتند از: µg/ml 8000، µg/ml 4000، µg/ml 2000، µg/ml 1000، µg/ml 500، µg/ml 250، µg/ml 125، µg/ml 5/62 و µg/ml 25/31
۳-۲-۱۳- بررسی اثر ضد میکروبی عصاره و اسانس و نانو ذرات نقره به روش انتشار چاهک
در این روش از پلیتهای یک بار مصرف استریل ۱۰ سانتیمتری استفاده شد که هر کدام حاوی ۲۵ میلیلیتر محیط MHA بودند، که ابتدا سطح پلیت آغشته به میکروارگانیسمها به غلظت ۵/۰ مک فارلند گردید و سپس با انتهای پیپت پاستور استریل، یک چاهک در محیط کشت به قطر ۶ میلیمتر ایجاد شد و داخل هر چاهک به میزان Lµ ۱۰۰ از غلظتهای که آماده کرده بودیم، همراه شاهد منفی (حلال) و شاهد مثبت (آنتیبیوتیک) ریخته شد. سپس پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفته شد. بعد از طی این مدت زمان قطر هاله عدم رشد اندازه گیری شد. این روش ۳ بار تکرار شد و میانگین قطر هاله عدم رشد در غلظتهای مختلف بدست آورده شد.
۳-۲-۱۴- تهیه شاهد مثبت
از ویال ونکومایسین mg/ml 500، غلظت mg/ml 25 تهیه شد و از آن به عنوان شاهد مثبت برای باکتری های گرم مثبت و از ویال جنتامایسین mg/ml40، غلظت mg/ml20 تهیه شد و از آن به عنوان شاهد مثبت برای باکتری گرم منفی استفاده شد و به میزان Lµ ۱۰۰ از آن در چاهکها ریخته شد.
۳-۲-۱۵- تهیه شاهد منفی
حلال۱۰% DMSO و آب مقطر استریل، به عنوان شاهد منفی برای تمام باکترهای ذکر شده انتخاب و به میزان Lµ ۱۰۰ از آن در هر چاهک ریخته شد.
۳-۲-۱۶- آماده سازی ترکیب نانو ذرات نقره و عصاره و اسانس آویشن شیرازی
بعد از انجام آزمایشات مربوط به عصاره، اسانس و نانو ذرات نقره هر کدام به تنهایی و بدست آوردن میانگین هاله عدم رشد در باکتری ها، ۳ غلظت بیشترین، کمترین و غلظت متوسط را با توجه به اثرات ضد باکتریایی هر کدام انتخاب شد. کمترین غلظت نانو ذرات نقره به صورت ضربدری با کمترین، بیشترین و غلظت متوسط عصاره و اسانس به نسبت مساوی ترکیب شد. سپس غلظت متوسط نانو ذرات نقره با کمترین، بیشترین و غلظت متوسط عصاره و اسانس ترکیب گردید و همین کار با بیشترین غلظت نانو ذرات نقره انجام داده شد. به این صورت که با کمترین، بیشترین و غلظت متوسط عصاره و اسانس به نسبت مساوی از هر کدام ترکیب شد. در نهایت ۹ ترکیب متفاوت بدست آمد و به مقدار Lµ ۱۰۰ از هر کدام این ترکیبها، درون چاهکها ریخته شد. سپس به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. بعد از طی زمان مورد نظر اندازه قطر هاله عدم رشد اندازه گیری شد. تمام آزمایشات فوق ۳ بار تکرار شدند.
۹ ترکیب تهیه شده به صورت زیر میباشد:
کمترین غلظت نانو ذرات نقره + کمترین غلظت عصاره گیاه
کمترین غلظت نانو ذرات نقره + غلظت متوسط عصاره گیاه
کمترین غلظت نانو ذرات نقره + بیشترین غلظت عصاره گیاه
غلظت متوسط نانو ذرات نقره + کمترین غلظت عصاره گیاه
غلظت متوسط نانو ذرات نقره + غلظت متوسط عصاره گیاه
غلظت متوسط نانو ذرات نقره + بیشترین غلظت عصاره گیاه
بیشترین غلظت نانو ذرات نقره + کمترین غلظت عصاره گیاه
بیشترین غلظت نانو ذرات نقره + غلظت متوسط عصاره گیاه
فرم در حال بارگذاری ...