وبلاگ

۲-۱۳-۲- مسیرهای آپوپتوزی
ملکول­های متعددی در فرایند آپوپتوز درگیر هستند. تحریک ملکول­های پروآپوپتوزی و یا مهار فاکتورهای آنتی آپوپتوتیک بستگی به نوع سلول و محرک دارد. دو مسیر اصلی آپوپتوز، مسیر خارجی یا مسیر وابسته به گیرنده­های مرگ و مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی و یک مسیر فرعی آن، آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳ می­باشد .(Hashemi & Kroczak., 2005, Xu G & Shi Y., 2007)

 

1. 1. مسیر خارجی یا آپوپتوز القاء شده توسط گیرنده­های مرگ

 

در غشاء پلاسمایی اغلب سلول­ها گیرنده­های مرگ وجود دارد. گیرنده­های مرگ، اعضاء ابر خانواده گیرنده فاکتور نکروز دهنده می­باشند. زمانی که این گیرنده­ها توسط لیگاند­های مربوطه تحریک می­شوند، سبب فعال شدن کاسپاز­ها و القاء آپوپتوز می­گردند. ویژگی این ابر خانواده وجود توالی غنی از سیستئین در بخش خارج سلولی است. این گیرنده­ها در بخش سیتوپلاسمی خود دارای توالی به ­نام ناحیه مرگ بوده و ازاین رو در انتقال پیام آپوپتوزی به درون سلول شرکت می­نمایند. شناخته­ترین گیرنده­های مرگ عبارتند از :
Apo1, NFR1, TR2/Fas/CD95, R2-TRAIL/R1, DR5- TRAIL/DR4
تحریک گیرنده­های مرگ توسط لیگاند­های مربوطه، منجر به تریمریزاسیون گیرنده و به­کار گیری پروتئین­های آداپتور می­گردد. برای مثال لیگاند(CD95L) با گیرنده مربوط به خود(CD95R) میان­کنش نموده باعث القاء تریمریزاسیون آن می­ شود. این عمل باعث تشکیل خوشه مرگ در ناحیه سیتوزولی گیرنده گردیده و باعث می­­شود که پروتئین­های آداپتور از قبیل FADD /Mort1 به آن متصل شوند. FADD دارای ناحیه مرگ(DD) در قسمت C ترمینال خود می­باشد که این پروتئین را قادر می­سازد تا به گیرنده تریمریزه شده از طریق میان کنش ناحیه مرگ- ناحیه مرگ متصل گردد. همچنین این پروتئین در ناحیه N- ترمینال دارای ناحیه مو^ءثر مرگ (DED) می­باشد که با ناحیه DED مشابه در پرودمین کاسپاز -۸ میان­کنش می­ کند.

به این کمپلکس پروتئین­ها(مجموعه لیگاند گیرنده مرگ، مولکول آداپتور و پروکاسپاز) کمپلکس علامت دهنده القاء مرگ(DISC) گفته می­ شود. به این طریق پروکاسپاز-۸ به کاسپاز-۸ فعال تبدیل می­ شود. کاسپاز-۸ سبب فعال شدن کاسپاز­های اجرایی شده و در نتیجه فرایند آپوپتوز صورت می­گیرد(Delirezh, 2000).
۲- مسیر داخلی آپوپتوز یا مسیر میتوکندریایی
میتوکندری­ هم در حیات و هم در مرگ سلول دخالت دارد. این ارگانل انرژی سلول را به فرم ATP فراهم می­سازد، هوموستاز داخل سلولی را در ارتباط با یون­ها و استرس­های اکسیداتیو حفظ می­نماید. در پاسخ به سیگنال­های مرگ سلولی، نفوذپذیری غشاء خارجی میتوکندری سبب آزاد شدن مولکول­های پروآپوپتوتیک از قبیل فاکتور القاء کننده آپوپتوز (AIF) و سیتوکروم c، DIABL/ Smac و آندونوکلئاز G از فضای بین دو غشاء میتوکندری به داخل سیتوپلاسم می­ شود.(Adrain & Martin., 2001)
DIABLO/Smac اثر آنتاگونیستی روی مهار کنندگان کاسپاز دارد. فاکتور القاء کننده آپوپتوز(AIF) یک فلاوپروتئین ۵۷ کیلودالتونی است که در حالت طبیعی نقش آنتی­اکسیدانی در میتوکندری برعهده دارد. بیان شده است که AIF آزاد شده از میتوکندری در طی روند آپوپتوز سبب آسیب به DNA هسته­ای در مسیر مستقل از کاسپاز می­ شود(Du et al., 2000).
به نظر می­رسد که آزاد شدن سیتوکروم c یک واقعه معمول درآپوپتوز است و مکانیسمی که آزاد شدن آن را کنترل می­ کند در دست بررسی است. مکانیسم­های احتمالی شامل باز شدن منفذ انتقال نفوذپذیری میتوکندریایی، وجود کانال اختصاصی برای سیتوکرومc در غشاء خارجی میتوکندری و یا تورم و پاره شدن شدن غشاء خارجی میتوکندری بدون از دست دادن پتانسیل غشائی می­باشد. ۱-Apaf در حالت عادی در سلول به صورت بی اثر و غیر فعال حضور داشته و در پروسه آپوپتوز به سبب رهایی سیتوکروم c از میتوکندری فعال می­گردد. این پروتئین در ناحیه انتهای آمینی دارای دومینCARD و در انتهای کربوکسیلی دارای چندین بخش تکراری از موتیف ۴۰ – WDمی­باشد. برای فعال شدن پروتئین ۱-Apaf ایجاد میان کنش بین این پروتئین و سیتوکروم c ضروری است(Hengartner., 2000).
با مکانیسمی که به درستی مشخص نیست، سیتوکروم c و ATP/dATP باعث الیگومریزه شدن ۱-Apaf می­گردند. توالی CARD پروکاسپاز-۹ با نسبت یک به یک به ناحیه CARD در ۱-Apaf متصل گشته و سبب فعال شدن کاسپاز-۹ می­ شود، کاسپاز-۹ فعال سبب فعال شدن کاسپاز­های اجرایی از قبیل کاسپاز ۳ و ۷ می­ شود. مجموعه پروتئین ۱-Apaf، سیتوکروم c و پروکاسپاز -۹ را آپوپتوزوم می­نامند. در مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی کاسپاز آغازگر کاسپاز-۹ می­باشد. کاسپاز-۹ سبب فعال شدن کاسپاز­ های اجرایی (کاسپاز۳، ۶ و۷) می­گردد و در نتیجه کاسپازهای اجرایی روی سوبسترا­های خود عمل می­نمایند و فرایند آپوپتوز صورت می­گیرد.
۳-آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳
در برخی از رده­های­ سلولی آپوپتوز غیر وابسته به کاسپاز-۳ صورت می­گیرد. لنفوسیت­های Tسیتوتوکسیک و سلول­های کشنده طبیعی ممکن است مستقیما از طریق مسیر وابسته به رسپتور کاذب در سلول­های هدف ایجاد آپوپتوز نمایند. در این حالت گرانول­های محتوی گرآنزیمB (GrB) که یک سرین پروتئاز است همراه با پرفورین تحویل غشاء پلاسمایی سلول­های هدف داده می­ شود. پرفورین پروتئینی است که سبب ایجاد حفره در غشاء پلاسمایی می­ شود و اجازه می­دهد که گرآنزیم آبشاری فعال شدن کاسپاز­ها را به راه اندازد. کاسپاز­ها جزء خانواده سیستئین پروتئاز هستند که نقش محوری در شروع و فاز اجرایی آپوپتوز ایفاء می­ نمایند. به­دنبال فعال شدن، این آنزیم­ها روی سوبسترا­های خاصی عمل نموده و تغییرات بیوشیمیایی و مورفولوژیک در سلول آپوپتوتیک ایجاد می­نمایند. از جمله چروک شدن سلول، متراکم شدن کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و… بنابراین ارزیابی فعالیت کاسپاز به عنوان یک مارکر بیوشیمیایی آپوپتوز مطرح است.
۲-۱۴-ویتامین^[۴۹]
کلمه ویتامین از واژه یونانی ویتا به معنی زندگی گرفته شده است. ویتامین­ها از جمله ترکیبات آلی هستند که در مقدار خیلی کم، برای اعمال حیاتی بدن و رشد و نمو موجود زنده ضرورت دارند. تغذیه ناقص و رژیم غذایی نامناسب اغلب سبب کمبود یا فقدان یک یا چند ویتامین در بدن موجود زنده می‌شود و به بیماری‌های مختلف مانند بری بری و پلاگر می‌ انجامد. اغلب عمل آنها بر روی بافت­های اپی تلیال و استخوان بوده و در مجموع هر کدام از آنها از بروز یک عارضه جلوگیری می‌کنند. فونک نام Vitalamine، یعنی آمینی که حیاتی بوده و برای ادامه زندگی ضرورت دارد، را به موادی که سبب بهبود بیماری بری بری می‌شدند و از گروه آمین بودند اطلاق کرده بود. پس از آنکه معلوم شد بسیاری از ویتامین­ها از گروه آمین نیستند حرف e از آخر واژه ویتامین حذف و واژه Vitamin مورد قبول واقع شد.
۲-۱۴-۱- انواع ویتامین
ویتامین­ها در دو دسته ویتامین­های محلول در آب و ویتامین­های محلول در چربی قرار می­گیرند. ویتامین E، ویتامین K، ویتامین Dو ویتامین A از جمله ویتامین­های محلول در چربی و ویتامین C و ویتامین‌های گروه B را محلول در آب می­باشند.
۲-۱۴-۲- ویتامین D
ویتامین D به معنای دقیق کلمه ویتامین نیست و نامی است که به گروهی از پیش‌سازهای هورمون‌های^[۵۰] محلول در چربی داده‌اند. پیش‌سازهای هورمون‌ها، معمولاً خودشان فعالیت هورمونی اندکی دارند. دو شکل عمده ویتامین D در بدن انسان شامل ویتامین D2 یا ارگوکلسیفرول و ویتامین D3 یا کوله کلسیفرول می­باشد. ویتامین D3 به‌ طور طبیعی هنگامی توسط بدن ‌تولید می‌شود که پوست در معرض نور فرابنفش موجود در پرتو‌های آفتاب قرار می‌گیرد. ویتامین D2 و ویتامین D3 به‌صورت تجاری هم تولید می‌شوند. فرم فعال ویتامین D در بدن، یعنی ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 یا کلسیتریول، از ویتامین D2 یا ویتامین D3 ساخته می‌شود. برای ساخته شدن این فرم فعال، ویتامین D2 و ویتامین D3 در کبد تغییر می‌یابند تا ۲۵ – Hydroxyvitamin D تولید شود، که این ماده از طریق خون به کلیه‌ها می‌رسد و در آنجا باز هم تغییر نموده و به‌صورت ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 درمی‌آید(Bell TD et al;2010).
هیدروکسیله کردن کوله کلسی فرول و تبدیل آن به کلسی دیول در کبد
هیدروکسیله کردن کلسی دیول تبدیل آن به کلسی تریول در کبد
ویتامینD3 به رشد و استحکام استخوان‏ها از طریق کنترل تعادل کلسیم و فسفر کمک می‌کند. ۱۰ تا ۲۰ دقیقه ماندن در زیر نور آفتاب، نیاز روزانه بدن انسان به این ویتامین را تامین می‌کند(شهبازی ملک نیا،۱۳۹۱).
مطالعات اپیدمیولوژی نشان می­ دهند در مناطقی که در معرض بیشتر نور خورشید هستند، به دلیل نقش مهمی که اشعه ماورا بنفش در تولید ویتامینD3 دارد، شیوع بیماری­های خودایمن کمتر است(,۲۰۰۶٫Cantorna). این ویتامین با ایجاد افزایش جذب فسفر و کلسیم از روده‌ها و کاهش دفع از کلیه به متابولیسم استخوان‌ها کمک می‌کند و همچنین از طریق ترجمه ژن­های هسته سلول، به­­­­­ رشد سلول کمک می‌کند. همه اعضای خانواده هورمون­های استروئیدی در تنظیم بیان ژن­ها نقش دارند(Smyk et al 2013). شیوع کمبود ویتامینD3 به خصوص در زنان و کودکان ایرانی بین ۵۰ تا ۸۰ درصد است. کمبود این ویتامین باعث پوکی استخوان در کهن سالی، باعث بروز بیماری‌هایی مانند راشیتیسم در کودکان، استئومالاسی در بزرگسالان، افزایش احتمال ابتلا به سرطان سینه یا پروستات شده و در نهایت باعث می‌شود که دستگاه ایمنی بدن ضعیف شود(Schwarz et al.,2005). ویتامین D3دارای اثرات متعددی بر سیستم ایمنی بدن می­باشد و گیرنده این هورمون در بسیاری ازسلول­های ایمنی شامل ماکروفاژ، سلول­های دندریتیک، لنفوسیت­ها و سلول­های NK بیان می­ شود(van Etten et al.,2005). وقوع بیماری­های خود ایمن از قبیل MS و IBD در کشور­های پیشرفته طی ۵۰ سال اخیر افزایش چشمگیر یافته است( Cantorna et al.,2010). برای توجیه افزایش وقوع چنین بیماری­های خود ایمن با محدودیت­های جغرافیایی به فاکتورهای محیطی متعددی اشاره شده است. در این بین توجه زیادی به نقش ویتامین ۱α,۲۵-dihydroxyvitamin D3 به عنوان یک ترکیب تعدیل کننده سیستم ایمنی شده است(Carlson et al.,2013). مجموعه اثرات کاهش فعالیت در فضای باز، افزایش جمعیت و رژیم غذایی که دارای مقدار کافی ویتامینD نمی ­باشد موجب ایجاد یک نوسان بزرگ در میزان ویتامینD موجود در میان جمعیت کشور های پیشرفته و به ویژه در میان جمعیت­هایی که فصل زمستان طولانی­تری را می­گذرانند، شده است(Namgung et al.,1995). هم­چنین مصرف ویتامین D3 در سلامت مغز و جلوگیری از آلزایمر موثر است. تحقیقات اخیر نشان می دهند که ویتامین D3 که شکل فعال ویتامین D می­باشد در تعدیل پاسخ­های ایمنی نقش دارد. در جوامعی که غذاهای سرشار از ویتامین D مصرف می­ کنند شیوع بیماری­های خود ایمن کمتر است و این خود شاهدی بر خاصیت تعدیل ایمنی توسط ویتامینD3 و ارتباط آن با سیستم ایمنی می­باشد(VanAmerongen et al.,2004).
فصل سوم:
مواد وروش کار
Materials & Methods
۳- مواد و روش کار
این فصل به بیان و شرح مواد، لوازم و روش­های بکار گرفته شده در روند آزمایشگاهی بررسی حاضر می ­پردازد. تمام مراحل آزمایشگاهی از جمله کشت سلول بنیادی مزانشیم رت، برداشت مایع رویی سلول و تست­های انفجار تنفسی، فاگوسیتوز و آپوپتوز در آزمایشگاه ایمنی شناسی، آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی و مرکز تخصصی کشت سلول بخش ایمنی­شناسی(در جریان هوای هود لامینار) گروه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی ارومیه صورت گرفت. از طرفی حیوانات آزمایشگاهی (رت) در مرکز نگهداری و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی ارومیه پرورش و نگهداری شد. در این مطالعه، به جهت ایجاد اختلاف کم در نژاد رت­های مورد آزمایش، به منظور تیمار سلول مزانشیم و مجاور سازی با سلول نوتروفیل، اقدام به پرورش و تکثیر این حیوان در مدت ۷-۶ ماه قبل از انجام پروژه نمودیم. از موش­های سن ۸-۶ هفته جهت استحصال سلول مزانشیم و از سن ۶-۵ ماهه برای خون­گیری استفاده شد.
۳-۱- طرز تهیه محیط کشت DMEM
مواد و وسایل مورد نیاز

 

1. 1. هود لامینار (Beasat, Iran)

 

1. 1. پودر محیط کشت DMEM(Gibco, UK)

 

1. 1. ال- گلوتامین(Sigma)

 

1. 1. بیکربنات سدیم(NaHCO3) (Merck)

 

1. 1. پنی سیلین G (U/ml100) (شرکت جابربن حیان)

 

1. 1. استرپتومایسین (mg/ml1/0) (شرکت جابرابن حیان)

 

1. 1. محلول اسید کلریدریک ۱/۰ مولار(HCL 0.1 molar) (Merck)

 

1. 1. محلول هیدروکسید سدیم ۱/۰ مولار(NaOH 0.1 molar)

 

1. 1. آب مقطردیونیزه (شرکت QAL انگلستان)

 

1. 1. ترازو دیجیتال(Nikon, Japan)

 

1. 1. ارلن مایر ۱ لیتری

 

1. 1. استوانه مدرج ۵۰۰ میلی لیتری

 

1. 1. شیشه در پیچ دار جهت نگه داری محیط کشت در اندازه های ۲۵۰ و ۵۰۰ میلی لیتری استریل

 

1. 1. همزن مغناطیسی

 

1. 1. PH متر

 

1. 1. دستگاه فیلتر استریل (شامل: قیف، ارلن شیردار و کاغذ صافی) و پمپ خلاء

 

1. 1. پمپ پریستالتیک حاوی آب مقطر

 

1. فویل آلومینیومی