وبلاگ

غلظت(mM)
غلظت(g/L)
نمک

۲۰۰
۲/۱۴
Na₂H PO₄

۲۰۰
۸/۷
NaH₂ PO₄

۳-۲-۳-۲- تهیه ی محلول استوک ANS
ANS پروب فلورسانسی است که اغلب به سطوح آبگریز مولکول متصل می شود و ضمن اتصال با برانگیختگی در طول موج ۳۶۵ نانومتر، این ماده در محدوده ی طول موج های ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر نشر خواهد داشت. برای تعیین غلظت استوک ANS، ۱۰ میکرولیتر از این استوک با ۹۹۰ میکرولیتر آب دی یونیزه مخلوط شد. سپس با توجه به ضریب جذب مولیANS ( M^-1cm^-14950) محلول استوک این ترکیب تعیین غلظت شد (استوک ANS معادل ۱۱ میلی مولار خواهد بود). آنگاه بقیه غلظت های لازم با بهره گرفتن از معادله ی ۳-۱ تهیه شد.

معادله ی ۳-۱ N₁V₁=N₂V₂
شکل۳-۲- نمایی از طیف جذبی ANS.
۳-۲-۳-۳- تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین T
هنگامی که تیوفلاوین T به ساختارهای غنی از صفحات بتا متصل می شود، شدت فلورسانس آن افزایش می یآبد که از این خاصیت برای تعیین کمی و کیفی تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی استفاده می شود. این ماده در طول موج ۴۲۰ نانومتر دارای حداکثر جذب است (Darghal و همکاران ۲۰۰۶). رنگ تیوفلاوین T برای مطالعه ی فیبریلاسیون پروتئین ها استفاده می شود. برای تعیین غلظت استوک ThT، ۵ میکرولیتر از این استوک با ۹۹۵ میکرولیتر آب دی یونیزه مخلوط شد. غلظت استوک ThT با توجه به ضریب جذب مولی این ترکیب
(cm^-1 M^-1 ۲۴۴۲۰) در طول موج ۴۲۰ نانومتر و ضریب رقت آن (۲۰۰) تعیین شد (۵ میلی مولار). آنگاه بقیه غلظت های لازم با بهره گرفتن از معادله ی ۳-۱ تهیه شد.
شکل۳-۳- نمایی از طیف جذبی تیو فلاوین-T.
۳-۲-۳-۴- تهیه محلول استوک کنگورد
برای بررسی تشکیل یا عدم تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی از محلول کنگورد استفاده شد. کنگورد دارای جذب حداکثر در طول موج ۴۹۸ نانومتر است. با قرار گیری این ترکیب در بین صفحات بتا طیف جذبی آن افزایش یافته و به دلیل جا به جایی آبر الکترونی جا به جایی به سمت طول موج های بیشتر (قرمز) را باعث می شود. بدین منظور طیف جذب نوری کنگورد در فاصله ۴۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر در غیاب و حضور نمونه پروتئینی اندازه گیری شد. برای تعین غلظت ۱۰ میکرو لیتر این استوک با ۹۹۰ میکرو لیتر آب دی یونیزه مخاوط شد، سپس با توجه به ضریب جذب کنگورد در آب(cm^-1 M^-1 ۴۵۰۰۰) غلظت محلول کنگورد تعیین گردید. استوک کنگورد با غلظت نهایی ۱۰ میکرو مولار استفاده شد و آنگاه بقیه غلظت های لازم با بهره گرفتن از معادله ۳-۱ تهیه شد.
شکل ۳-۴- نمایی از طیف جذبی کنگو رد.
۳-۲-۳-۵- تهیه محلول OPA
به منظور مطالعه میزان استیلاسیون پروتئین از ترکیب OPA استفاده شد. OPA ترکیبی است که به گروه های آمین آزاد در پروتئین متصل می گردد. محلول OPA باید بلافاصله پیش از انجام آزمایش مربوطه تهیه گردد. این محلول مطآبق روش Fayle و همکاران، ۲۰۰۱ تهیه شد. به طور خلاصه، به ۲۵ میلی لیتر محلول سدیم بورات ۱۰۰ میلی مولار تهیه شده ۵/۲ میلی لیتر سدیم دو دسیل سولفات (SDS ) 20 درصد ، ۱۰۰ میکرولیتر بتا مرکاپتو اتانول (β-ME) و یک میلی لیتر متانول حاوی ۴۰ میلی گرم پودر OPA اضافه شد. سپس حجم نهایی محلول به وسیله ی آب مقطر به ۵۰ میلی لیتر رسانده شد.
شکل۳-۵- نمایی از ساختار ترکیب .OPA
۳-۲-۳-۶- تهیه محلول فلورسامین
از نشر فلورسانس ترکیب فلورسامین برای تعیین میزان استیلاسیون پروتئین انسولین استفاده شد. جهت تهیه محلول یک میلی مولار فلورسامین مقدار مشخصی از پودر این ترکیب وزن و در حلال استونیتریل حل شد. در نهایت محلول تهیه شده به وسیله دستگاه فلورسانس در طول موج ۳۹۰ نانومتر برانگیخته شد. سپس طیف نشری آن بین طول موج های ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر جمع آوری شد.
شکل۳-۶- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین.
۳-۲-۴- تهیه محلول های مورد نیاز ژل الکتروفورز
۳-۲-۴-۱- تهیه محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید
برای تهیه محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید ۱۵ گرم پودر آکریل آمید و ۴/۰ گرم پودر بیس آکریل آمید در آب مقطر حل شد و سپس حجم آن به ۵۰ میلی لیتر رسانده شد. این محلول بعد از فیلتراسیون تا زمان استفاده در یخچال نگهداری می شود.
۳-۲-۴-۲- تهیه محلول ۲۰ درصد SDS
برای تهیه این محلول ۲۰ گرم پودر SDS در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل و سپس در دمای اتاق نگهداری می شود.
۳-۲-۴-۳- تهیه محلول ۱۰ درصد آمونیوم پرسولفات (APS)
آمونیوم پرسولفات رادیکال های آزاد را برای پلیمریزاسیون آکریل آمید و بیس آکریل آمید فراهم می نماید. برای تهیه این محلول ۱/۰ گرم پودر آمونیوم پرسولفات در ۱ میلی لیتر آب مقطر حل شد. برای هر بار تهیه ژل بایستی این محلول به صورت تازه تهیه شود.
۳-۲-۴-۴- تهیه محلول بافر تریس ۵/۱ مولار
محلول بافر تریس ۵/۱ مولار با pH برابر ۸/۸ برای تهیه ژل جداکننده استفاده می شود. مقدار لازم از پودر تریس بازی در ۴۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می شود و بعد از تنظیم pH با HCl در نقطه ۸/۸، حجم آن با آب مقطر به ۵۰۰ میلی لیتر رسانده می شود. برای حذف ذرات معلق این مخلوط به کمک کاغذ صافی فیلتر شد و آنگاه تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۳-۲-۴-۵- تهیه محلول بافر تریس ۵/۰ مولار
محلول بافر تریس ۵/۰ مولار با pH برابر ۸/۶ برای تهیه ژل استاکینگ استفاده می شود. مقدار لازم از پودر تریس بازی در ۴۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می شود و بعد از تنظیم pH با HCl در نقطه ۸/۶، حجم آن با آب مقطر به ۵۰۰ میلی لیتر رسانده می شود. برای حذف ذرات معلق این محلول به کمک کاغذ صافی فیلتر شد و تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
۳-۲-۴-۶- تهیه محلول بافر تانک
این بافر برای هدایت جریان الکترسیته در ژل و حرکت پروتئین ها بر روی ژل استفاده می شود. این محلول از سه ماده گلایسین، تریس بازی و SDS تشکیل شده است. مقادیر لازم برای ساخت ۱ لیتر از این بافر در جدول ۳-۲ آمده است.
جدول۳-۲- مقادیر لازم برای تهیه ی ۱ لیتر بافر تانک.